重金属汞酶联免疫检测方法的建立

方淑兵，王俊平，王 硕，张 燕，生 威，王 津，杨依锦

（天津科技大学食品安全管理与战略研究中心，天津300457）

重金属汞酶联免疫检测方法的建立

方淑兵，王俊平*，王 硕，张 燕，生 威，王 津，杨依锦

（天津科技大学食品安全管理与战略研究中心，天津300457）

建立了重金属汞离子的间接竞争酶联免疫（IC-ELISA）分析方法。由于汞离子不具有免疫原性，因此以异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE）为双功能螯合剂连接汞离子和钥孔血蓝蛋白（KLH）作为免疫原，免疫新西兰大白兔获得特异性抗体。用获得的抗体建立汞的ELISA分析方法。检测限为0.45μg/L，灵敏度为4.10μg/L。特异性实验表明，抗体对镍和铜的交叉反应率分别为10.8%和13.5%，与其他金属均无明显交叉反应。本实验以白芷、胡萝卜和皮皮虾为基质，添加回收实验表明，白芷、胡萝卜、皮皮虾回收率均在70%～120%。使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）验证方法的准确性，仪器检测结果和建立的ELISA分析方法具有很好的相关性（相关系数为0.988），表明建立的方法具有很好的准确性。

汞，酶联免疫，多克隆抗体

Abstract：An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay（IC-ELISA） was developed for the rapid detection of Hg（II）.As the mercury ion was not immunogenic，so mercury was linked to the keyhole limpet hemocyanin（KLH） with 1-（4-isothiocyanobenzyl） ethylenediamine-N，N，N’，N’-tetraacetic acid（ITCBE） as immunogen.For the developed ELISA，the limit of detection and sensitivity were 0.45μg/L and 4.10μg/L，respectively.The cross-reactivity against other metals were all low，except for copper and nickel，which had10.8%，13.5%corss-reactivity，respectively.The recoveries of dahurica，carrot and Pipi shrimp sample were ranging from 70%to 120%.The accuracy of the developed IC-ELISA method was validated by inductively coupled plasma mass spectrometry（ICP-MS）.The developed ELISA for dahurica sample showed high correlation with ICP-MS（the correlation coefficients were 0.988）.Thus，it was demonstrated that the established immunoassay for the detection of Hg（II） was reliable.

Key words：mercury；ELISA；polyclonal antibody

汞是自然界存在的在常温下唯一呈液态的金属元素，广泛的应用于生产和生活的各个领域。汞同时也是一种对生物具有很强毒性的金属元素，会给生态环境和农产品带来污染，对人类健康造成危害，比如甲基汞在食物链中富集，不仅毒害动物，而且影响人的肾、肺、大脑及免疫系统[1-2]。汞污染在世界的某些地区已成为大众健康的公害[3]。因此，对重金属汞的检测就显得尤为重要。目前常用的重金属检测方法主要包括紫外分光光度法（UV）[4]、原子荧光光谱（AFS）法[5]、原子吸收光谱（AAS）法[6]、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法[7]等。这些方法检测过程必须在集中大型分析仪器的室内进行，无法用于现场检测，具有费用高、处理量有限、检测时间长等缺陷[8]。因此，对于重金属汞的快速检测方法的研究一直没有停止过。国内外对重金属免疫快速检测方法已经有一定的研究成果[9]。然而，对于实际应用报道不多。本实验制备了重金属汞多克隆抗体、建立了免疫检测方法和复杂样品基质的前处理方法，并对汞的免疫检测方法进行了实际应用研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

汞、铅、镉、银、铜、铬、镁、镍、锰、铁单元素标准品 中国科学计量研究院；异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE） 日本化学同仁研究所；钥孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清蛋白（BSA）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、二甲基亚砜（DMSO）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N-（2-羟乙基）哌嗪-N’-2-乙烷磺酸（HEPES） 美国Sigma公司；浓硝酸（优级纯）、高氯酸（优级纯） 天津市化学试剂一厂；白芷 天津某大药房；胡萝卜、皮皮虾 天津某超市。

超纯水仪 美国MILLIPORE公司；酶标仪 美国Thermo公司；蛋白纯化仪 美国BIO-RAD公司；电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS） 美国Agilent公司；分析天平-BL610 赛多利斯仪器系统有限公司；高压消解罐 上海隆拓仪器设备有限公司；紫外分光光度计 日本岛津公司；96孔酶标板 丹麦Nunc公司。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫原和包被原的制备 取ITCBE 1.5mg溶于500μL的DMSO中，将ITCBE溶液缓慢滴加到0.68mL的1.0mg/mL硝酸汞标准溶中，待全部加入后，用三乙胺将反应物pH调到6.0，常温反应16h后形成ITCBE-Hg螯合物。取10mg KLH溶于pH9.0的HEPES缓冲溶液中，将螯合好的Hg-ITCBE缓慢滴加到蛋白溶液中，室温反应16h。反应完全后用20mmol/L的pH7.4的HEPES缓冲溶液进行透析，除去多余的小分子即形成KLH-ITCBE-Hg完全抗原。包被原用BSA制备，Hg2+和BSA的偶联方法与Hg2+和KLH的偶联方法相同。

1.2.2 标品的制备 由于Hg2+直接与抗体反应可使抗体变性，需要用螯合剂将金属离子螯合后才能用于检测[10]。本实验选用ITCBE作为Hg2+螯合剂。ITCBE和Hg2+螯合方法如下：1mg ITCBE溶于200μL的DMSO中，在磁力搅拌下向其中缓慢滴加455μL的1.0mg/mL的Hg2+标准物质（ITCBE和Hg2+的物质的量比为1∶1），然后用三乙胺调节反应物的pH至中性，室温搅拌反应16h，即形成标准本品ITCBE-Hg螯合物。

1.2.3 抗体的制备和纯化 选用月龄3个月，体重1.5kg左右的新西兰大白兔作为免疫动物。免疫采用背部皮下多点注射免疫，初次免疫的抗原用等体积弗氏完全佐剂混合乳化，加强免疫的抗原用等体积弗氏不完全佐剂混合乳化[11]。初次免疫后每隔两周进行一次加强免疫，共进行四次加强免疫。最后一次加强免疫后第10d从兔子股动脉取全血，离心后得到抗血清。采用Protein A-Sepharose 4B作亲合层析介质纯化抗血清[12]，可获得特异性抗体。

1.2.4 重金属汞间接竞争酶联免疫检测方法的建立

包被原BSA-ITCBE-Hg用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释成1μg/mL，包被在96孔酶标板上，100μL/孔，4℃孵育过夜。PBST洗板3次，每孔加入200μL封闭液（0.5%脱脂乳粉），室温放置1h。PBST洗板3次，空白孔中每孔加入100μL的PBS，控制孔中每孔加入50μL的PBS和50μL的抗体，其他每孔加入50μL梯度稀释的汞螯合物标品和50μL的抗体，室温振荡孵育1h。PBST洗板3次，加入HRP标记的羊抗兔，每孔100μL，室温振荡孵育30min。PBST洗板3次，加入底物液，每孔100μL，37℃显色10min。加入终止液，每孔50μL。酶标仪读数。计算不同浓度的汞对抗体与包被原的抑制率I（%）：

以抑制率为纵坐标，汞标样浓度为横坐标绘制标准曲线，求出灵敏度（IC50）和最低检出限（IC15）。

1.2.5 重金属汞抗体特异性的测定 实验选择金属镉、铅、镍、锰、铜、铬、铁、银、镁离子进行交叉反应的测定，检测抗体的特异性。按照建立的汞的间接竞争酶联免疫检测方法，用ITCBE螯合其他金属离子（Cd2+、Pb2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Cr2+、Fe2+、Ag+、Mg2+）代替汞标品，按照所建立的方法进行检测实验，计算出其他金属离子的IC50值，交叉反应率的计算公式为：

交叉反应率（CR，%）=IC50（汞离子）/IC50（其他金属离子）×100

1.2.6 样品的处理以及基质影响消除 实验选择白芷、胡萝卜和皮皮虾为基质，采用湿法硝化[13]处理基质：取一定量白芷、胡萝卜和皮皮虾肉干燥至恒重后研磨粉碎，分别准确称取1.0g样品，向其中加入5mL硝酸和1mL高氯酸，浸泡过夜，然后使用高压消解罐在300℃硝化至澄清，排出多余的酸后，调节硝化液pH至6.0，白芷和胡萝卜用双蒸水定容到25mL后过0.22μm的水膜可消除基质影响，皮皮虾用双蒸水定容到30mL后过0.22um的水膜可消除基质影响。

1.2.7 样品添加回收 实验选择白芷、胡萝卜、皮皮虾为基质，按下面的方法进行添加回收实验。白芷：称取三份干燥白芷各1.0g，分别添加30、100、350μL的1mg/mL的汞离子，即添加浓度分别为0.03、0.10、0.35mg/g。充分硝化后，调节pH到6.0，加入相同物质的量的螯合剂ITCBE，反应过夜，然后用双蒸水定容到25mL。按照步骤1.2.4方法进行汞间接竞争酶联免疫检测；胡萝卜的添加检测方法和白芷相同；皮皮虾中添加量分别为36、120、420μL的1mg/mL的汞离子，即添加浓度分别为0.036、0.12、0.42mg/g。硝化后用双蒸水定容到30mL，其他步骤和白芷相同。

1.2.8 方法验证 实验选用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）对建立的方法进行验证。按照步骤1.2.7方法对白芷进行添加，用建立的汞间接竞争酶联免疫方法和ICP-MS方法进行检测，对IC-ELISA方法与ICP-MS方法检测结果进行相关性分析。

2 结果与讨论

2.1 重金属汞抗原、包被原合成

由于Hg2+既没有免疫原性，也没有反应原性，为了能够制备针对汞离子的抗体，必须将汞离子与载体蛋白质连接，形成完全抗原[14]。汞离子与蛋白质直接反应，可使蛋白质变性。因此，我们选择双功能螯合剂ITCBE作为汞离子和蛋白质的连接桥[15]。

2.2 标准曲线的建立

图1 重金属汞间接竞争ELISA标准曲线Fig.1 Competitive indirect ELISA standard curve of mercury

由于抗体不能直接识别Hg2+，因此需要用螯合剂ITCBE螯合形成ITCBE-Hg螯合物才能进行抗原抗体反应[16]。方法的检测限定义为：在标准曲线上，抑制率为15%时对应的汞标准品的浓度值，用IC15表示。灵敏度定义为：在标准曲线上，抑制率在50%时对应的汞标准品的浓度值，用IC50表示。由图1可知，建立的汞间接竞争酶联免疫方法的检测限为0.45μg/L，灵敏度为4.1μg/L。

2.3 抗体的特异性

抗体的特异性用交叉反应率来衡量，结果见表1。

表1 汞抗体的交叉反应Table 1 Cross-reactivity of mercury antibody

由表1可知，抗体对镍和铜的交叉反应率分别为10.8%和13.5%，与其他金属均无明显交叉反应，表明抗体的特异性较好。

2.4 样品的处理

由于样品中的汞大多数是以结合态存在的，为了检测样品中的汞，需要对基质进行预处理。目前主要的处理方法为干法灰化和湿法硝化。由于汞是挥发性元素，不适合用干法硝化[17]，因此采用湿法硝化处理。湿法硝化包括常压/高压湿法硝化及常压/密闭高压微波硝化。由于密闭高压湿法硝化处理，具有设备简单、损失小、效率高的特点[18]，因此选用该法对样品进行处理。硝化后调节硝化液pH至中性，胡萝卜硝化后用双蒸水定容到25mL，过0.22μm的水膜，可以消除基质影响。皮皮虾硝化后用双蒸水定容到30mL过0.22μm的水膜，可以消除基质影响，见图2。

图2 基质影响消除曲线Fig.2 Matrix influence of samples

2.5 回收率

添加不同水平汞离子，进行添加回收率测定。结果见表2。由表2可知，所有样品的回收率都在70%～120%，说明建立的方法具有很好的准确性。

在实际样品检测中，由于盲样中汞的浓度是未知的，因此加入的螯合剂ITCBE的量必须是过量的，盲样中加入的ITCBE的物质的量一般是盲样中汞残留限量（国家标准）的5～10倍。

表2 重金属汞间接竞争ELISA添加回收（n=3）Table2 RecoveryofmercuryfromspikedsamplesbyELISA（n=3）

2.6 相关性分析

ELISA方法和ICP-MS方法检测白芷中Hg2+结果相关性比较见图3。两种方法的线性相关系数R2=0.988。这表明，同一份样品同时用两种检测方法测得的结果一致性很高，进一步证明本实验所建立的汞间接竞争ELISA检测结果具有较高的准确性。

图3 ELISA和ICP-MS检测结果相关性Fig.3 Comparison of ELISA and ICP-MS for determination of mercury

3 结论

本实验成功制备了抗汞离子的特异性多克隆抗体，并建立了一种快速有效的检测重金属汞离子的间接竞争酶联免疫（IC-ELISA）方法。样品经硝化和稀释即可用于检测，2.5h即可完成样品全部检测过程，检测效率较高，样品检测限低，回收率较高，变异性小。本实验建立的间接竞争ELISA方法不需要大型仪器设备，与仪器检测方法相比，具有检测费用更低，可以同时检测大量样品的优点。通过与ICP-MS检测结果比较，证明该方法检测结果准确、可靠。

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Development of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of Hg（II）

FANG Shu-bing，WANG Jun-ping*，WANG Shuo，ZHANG Yan，SHENG Wei，WANG Jin，YANG Yi-jin
（Key Research Institute of Food Safety Strategy and Management，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

TS207.5+1

A

1002-0306（2012）16-0086-04

2011-12-07 *通讯联系人

方淑兵（1988-），男，硕士研究生，研究方向：营养与食品卫生学。

“十二五”“863”计划课题（2012AA101604）。