中国近海角木叶鲽（Pleuronichthys cornutus）种群遗传多样性研究

朱叶，章群，李贵生，刘海林，马奔，黄小彧，司从利

（暨南大学 水生生物研究所，广东 广州 510632）

中国近海角木叶鲽（Pleuronichthys cornutus）种群遗传多样性研究

朱叶，章群，李贵生，刘海林，马奔，黄小彧，司从利

（暨南大学 水生生物研究所，广东 广州 510632）

测定了中国沿海角木叶鲽4个群体57个体的线粒体控制区序列，在长度为549 bp的线粒体控制区序列中，检测到3个插入/缺失位点，24个变异位点（包括11个简约信息位点），共出现了37个单倍型，其中9个为共享单倍型。角木叶鲽整体的单倍型多样度（Hd）和核苷酸多态度（Pi）结果分别为0.979±0.008和0.00655±0.0037，呈现出高单倍型多样度和低核苷酸多态度分布模式。中性检验结果显示，角木叶鲽种群的Fu's Fs为显著负值，核苷酸不配对分析呈现单峰分布，表明角木叶鲽在历史上经历过种群扩张事件。群体内个体间的平均遗传距离为0.0065，群体间遗传分化指数都为负值（-0.0067～-0.0460）但不显著（P>0.1），AMOVA分析显示遗传变异主要集中在群体内个体间（102.15%），均表明我国近海角木叶鲽种群无明显的分化，可以作为一个渔业管理单位加以保护和利用。

角木叶鲽；线粒体控制区；遗传多样性；群体遗传分化；种群历史动态

Abstract：The length of 549 bp mtDNA control region sequences of 57 individuals from 4 Pleuronichthys cornutus populations in the coastal waters of China was determined.3 insert/deletion sites，24 variable sites（including 11 parsinomy-informative sites） and 37 haplotypes were detected，of which 9 haplotypes were shared among populations.The global haplotype diversity（Hd） and nucleotide diversity（Pi） were 0.979±0.008 and 0.0061±0.0037 respectively，indicating a high haplotype diversity（Hd） and a low nucleotide diversity（Pi）.The significant negative values of neutral test of Fu's Fs and the unimodal mismatch distribution revealed a historical population expansion.As the average genetic distances within 4 populations were 0.0065，and genetic differentiation index（Fst） were negative（-0.0067～-0.0460） but not significant（P>0.1），and the majority genetic variation（102.15%）occurred within populations（102.15%）in AMOVA analysis，suggesting that Pleuronichthys cornutus populations in the coastal waters of China were not significantly differentiated and might be protected as a single management unit.

Keywords：Pleuronichthys cornutus； genetic diversity； mitochondrial DNA control region； stock genetic differentiation；demographic history

研究鱼类种群遗传多样性是评估种质资源现状，制定野生群体保护与恢复策略，实施养殖群体遗传改良的重要前提（Ward，2000）。中国地处西北太平洋，有着丰富的渔业资源，近年来一些学者开展了部分海洋鱼类种群结构和遗传变异研究（韩志强等，2006；蒙子宁等，2003），但到目前为止，对中国鲽形目鱼类的研究多停留在形态与地理分布、生长发育等生物学方面，如圆斑星蝶（陈四清等，2002）、钝吻黄盖鲽（孟天湘等，1986）等，而对遗传多样性的研究报道不多。角木叶鲽（Pleuronichthys cornutus） 隶属鲽形目（Pleuronectiformes）鲽亚目（Pleuronectoidei）鲽科（Pleuronectidae），仅分布于中国、日本和朝鲜沿海，是肉质细嫩鲜美、营养价值较高的海洋经济鱼类（Nelson，2006）。历史上我国角木叶鲽资源相当丰富，是沿海渔民的重要渔获对象，但近些年来因海水污染、富营养化、过度捕捞及产卵场地的破坏，野生资源迅速衰退（程庆贤等，1991）。

线粒体为单一母性遗传、几乎没有重组、进化速率快，能够检测传统渔业生物学方法无法反映的种群遗传特征，其中控制区是线粒体中进化速度最快的区域，能够较好地反映种群的遗传变异（Kocher et al，1997），为此本文分析了中国沿海4个角木叶鲽群体线粒体控制区序列的遗传多样性和遗传结构与种群历史动态，旨在为角木叶鲽资源的保护和合理开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

角木叶鲽样品采自辽宁丹东10尾（编号LDD1-10） 与东港4尾（编号LDG1-4），东港亦属丹东市，相隔较近，下文将LDG和LDD统称为辽宁群体；山东崂山14尾（编号SDLSh1-14），简称山东群体；浙江岱山13尾（编号ZJDSh1-13），简称浙江群体；广东饶平16尾（编号GDRP1-16），简称广东群体。样品采集后用95%乙醇保存备用。

1.2 基因组总DNA提取及PCR扩增测序

采用高盐法提取角木叶鲽总基因组DNA（Millers et al，1988）。PCR扩增的引物是根据Genebank中角木叶鲽的近缘类群的线粒体控制区序列设计的，正向引物为CrF：5’-gtagctcagtgttagagcgcca-3’，反向引物为CrR： 5’-agagaaccccttacccgctggag-3’。PCR反应在Biometra UNOⅡ仪上进行，PCR反应总体积30.0 μL（22.4 μL蒸馏水，3.0 μL10×Buffer，1.2 μLdNTP，1.2 μLBSA，左、右引物各 0.3 μL，0.6 μLTaq 酶，1 μL 模板 DNA）。PCR反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃，退火30 s，72℃延伸1 min，36个循环，最后72℃延伸10 min。经1%TAE琼脂糖凝胶检测合格的PCR产物送至北京六和华大基因有限公司切胶纯化，并在ABI3730 DNA自动测序仪上进行测序。

1.3 数据处理

序列由人工校正后，用MEGA5.0软件比对，计算序列碱基组成、变异位点、转换/颠换值、简约信息位点、群体内与群体间遗传距离，用邻接法（Neighbor-Joining，NJ） 构建系统发育树，各分支的置信度由 1000次自举法检验（Flesenste，1992）。使用Dnasp5.00计算单倍型数量、核苷酸多态性（Pi）、单倍型多样性（Hd）、遗传分化的系数（Fst）。用Arlequin 3.11软件进行分子方差分析（AMOVA），计算Tajima’s D和Fu’s Fs值，进行核苷酸不配对分析，获得τ值；用公式τ=2ut估算种群扩张时间（Rogers et al，1992），其中τ是扩张时间参数；u=μk，μ为控制区基因的变异速率，k表示序列长度；t表示自扩张以来所经历的代数；扩张时间T=t×生殖周期。

2 结果与分析

2.1 线粒体控制区的序列特征以及遗传多样性

获得线粒体控制区5’端序列549 bp，发现3个插入/缺失位点，24个变异位点，11个简约信息位点；共有3个位点发生转换，没有颠换，转换与颠换比为6.25，符合线粒体基因组DNA进化过程中转换频率高于颠换的规律，说明序列没有达到饱和，适合遗传分析。序列中A、T、C、G的含量分别为35.3%，29.5%，19.7%，15.5%，表现出明显的反G偏倚；A+T含量（64.8%）高于C+G含量（35.2%），符合鱼类线粒体DNA的一般规律（Hochachka，1993）。

群体遗传多样性参数见表1。4个角木叶鲽群体总体的单倍型多样性（Hd） 为0.979±0.008，核苷酸多态性（Pi）为0.006 55±0.003 7。群体内单倍型多样性在0.974±0.039～0.989±0.031之间，核苷酸多态性在 0.006 33±0.003 8～0.006 93±0.004 2之间，呈现单倍型多样性较高而核苷酸变异较低的特点。

2.2 遗传结构及种群历史动态

4个群体中共有37个单倍型，其中9个为共享单倍型；以Hap6出现次数最多，为4个群体所共享；其余单倍型为各个群体所特有。在以K-2-p模型构建的单倍型NJ树（图1） 中，不同地理来源的单倍型散乱分布，没有呈现明显的地理结构和谱系结构。4个群体间遗传距离在0.006～0.007之间，群体内个体间平均遗传距离为0.006 5，群体内和群体间的遗传距离处于同一水平，表明角木叶鲽群体遗传分化较低。另外，两两群体间的遗传分化指数均为负值（见表2），且AMOVA分析显示群体间的变异为-2.15%，而群体内个体间变异高达102.15%（P＞0.05），进一步表明4个地理群体间基因交流频繁，并无显著遗传分化（Wright，1978a）。

表1 角木叶鲽4个群体的遗传多样性参数

图1 基于角木叶鲽线粒体控制区序列构建的单倍型邻接树（分支上数字为Bootstrap值）

表2 角木叶鲽4个群体间的遗传分化指数（Fst）

高单倍型多样性与低核苷酸多态性的分布模式提示角木叶鲽可能经历了种群扩张（Bowen et al，1997）。将所有个体作为一个整体，进行Tajima’s D和 Fu’s Fs中性检验得 Tajimas’D=-1.31736（P＞0.10），Fu’s Fs=-40.296（P=0.000），即 Tajimas’D值不显著，而Fu’s Fs值显著。由于在相同条件下，Fu’s Fs检验对群体扩张非常敏感（Fu，1997），故可认为角木叶鲽可能经历过快速的种群扩张。另外将整体进行核苷酸不配对分析，结果呈单峰分布（见图2），同样说明角木叶鲽曾经历过种群扩张。根据τ的观测值3.8，以5%～20%每百万年线粒体控制区变异速率（Liu et al，2007），以生殖周期为3，可估出种群扩张发生在更新世中期到晚期之间（20.8～5.2万年）。

图2 角木叶鲽整体的核苷酸不配对分析图

3 讨论

3.1 角木叶鲽的遗传多样性与种群动态

遗传多样性丰富与否常用单倍型多样性、核苷酸多态性来衡量（Vrijenhoek，1994）。本研究中角木叶鲽整体的单倍型多样性为0.979±0.008，核苷酸多态性为0.006 55±0.003 7；4个群体的单倍型多样性和核苷酸多态性分别在0.974±0.039～0.989±0.031和 0.00633±0.0038～0.00693±0.0042之间，呈现高单倍型多样性和低核苷酸多样性分布模式，推测可能经历过瓶颈效应后的快速扩张（Frankham et al，2002），中性检测和核苷酸不配对分析也证实了这种推测。角木叶鲽出现这种分布模式的可能原因是单倍型多样性可在短时间内积累变异而快速提高，而核苷酸多态性短时间内达不到这种程度，从而导致高单倍型多样性与低核苷酸多态性现象的出现。中国沿海的白姑鱼（韩志强，2008）、花鲈（Liu et al，2006）、小黄鱼（彭博 等，2010）、真鲷（乐小亮 等，2010）、黑鲷（赵爽等，2010）、鳓鱼（吴常文等，2009）、黄鳍鲷（龚金波，2006）等都可能经历过类似于角木叶鲽的种群扩张。更新世中、晚期冰期旋回导致海平面多次大幅升降，海平面曾比今日低130多米，中国沿海大陆架大面积露出（Wang，1999），之后又被淹没，导致许多鱼类的栖息地经历了冰期的缩减和冰期后期的扩张，从而形成现代种群的遗传格局（Hewitt，2000）。

3.2 角木叶鲽的遗传分化

4个角木叶鲽群体内与群体间的遗传距离都很小（0.006～0.007），远小于Shaklee在1982年提出的鱼类在属、科、种上遗传距离分别是0.9，0.3，0.05 的分类标准（Shaklee et al，1982）；群体间遗传分化指数均为负值且在统计学上不显著；AMOVA分析也显示个群体间存在的地理隔离未对遗传变异的分布产生显著影响；这些都表明4个角木叶鲽群体间并无明显的遗传分化（Wright，1978b）。这种现象在海洋鱼类中较为常见（Palumbi，1994），可能原因如下：一是角木叶鲽在我国沿海广泛分布，虽然成鱼游泳能力较弱，但每年春、夏季临近时集群自越冬场游向近海产卵。其卵是漂浮性的，幼体也可能会随海流被动漂流，加上我国沿海并不存在明显影响基因交流的地理障碍，导致群体间基因交流频繁，分化程度不显著。二是经历冰期之后的角木叶鲽幸存个体进行了大范围的扩张，但其扩张时间尚短，尚未在迁移和遗传漂变间达到平衡（Palumbi，2003）。

3.3 角木叶鲽种质资源的管理和保护

中国近海角木叶鲽群体呈现高单倍型多样度和低核苷酸多态度分布模式，没有明显的地理和谱系结构，可作为一个管理保护单位（Moritz，1994）。近年来过度捕捞、海洋污染和产卵场受到破坏等原因，应该采取措施保护角木叶鲽的野生资源。本研究中涉及的地理群体较少，同时仅根据线粒体控制区还尚不足以全面揭示中国近海角木叶鲽群体中可能存在的细微种群遗传结构，为更好地管理保护和开发利用角木叶鲽资源，还应该采用进化速率更快的AFLP或SSR等分子标记技术，并综合传统的渔业调查和生理生态资料，尽可能准确地摸清角木叶鲽的资源状况，从而更好地保护与开发利用角木叶鲽种质资源。

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（本文编辑：袁泽轶）

Genetic diversity of four Pleuronichthys cornutus populations in coastal waters of China

ZHU Ye，ZHANG Qun，LI Gui-sheng，LIU Hai-lin，MA Ben，HUANG Xiao-yu，SI Cong-li
（Research Center of Hydrobiology，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Q347

A

1001-6932（2012）05-0552-05

2012-02-15；

2012-06-26

国家自然科学基金（30770415，41071034）；暨南大学科研创新基金（21609710，21611426）。作者简介：朱叶（1986-），女，广州，硕士研究生，细胞生物学方向。电子邮箱：zhu9ye@126.com。