枯草芽孢杆菌B1对饲喂高脂饲粮小鼠抗氧化功能的影响

徐 歆 毛予龙 李雅丽 胡胜兰 吴红照 李卫芬

(浙江大学动物科学学院饲料科学研究所，教育部动物分子营养学重点实验室，杭州 310058)

动物机体因氧化还原反应而产生自由基，却又存在着一套完善的抗氧化系统，防止自由基的过度累积，从而使自由基处于动态平衡之中，机体得以避免氧化损伤。当因应激而打破该平衡，致使自由基积累时，机体便处于氧化应激状态，从而使细胞内大分子(如脂类、蛋白质和核酸)结构和细胞功能受到损害［1］。过多的能量摄入可提高机体代谢水平，显著增加体内自由基，引发氧化应激［2］。所以饲喂高脂饲粮的小鼠常用作研究氧化应激的动物模型［3］。益生菌能够通过促进动物肠道内的菌群平衡，发挥促生长和提高抗病力等益生作用，因此已被开发为安全、有效的活菌制剂且广泛应用于各种畜禽和水产动物饲料中，并取得了良好效果。同时，部分益生菌(如乳酸菌、双歧杆菌和芽孢杆菌)还被发现具有一定的抗氧化作用。目前，关于芽孢杆菌抗氧化作用的报道不多。研究表明，纳豆芽孢杆菌可显著提高早期断奶仔猪血清谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH－Px)活性，显著降低血清丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量［4］;枯草芽孢杆菌可显著提高肉鸡血清与肝脏总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T－AOC)和 GSH－Px 活性，显著降低其血清MDA、一氧化氮和肝脏 MDA含量［5］。可见，芽孢杆菌能够增强正常状态下动物的抗氧化功能。不过，关于氧化应激状态下该益生菌对动物抗氧化功能的影响，仍有待研究。枯草芽孢杆菌B1是本实验室筛选得到的一株具有良好抗氧化作用的芽孢杆菌。本试验旨在探讨该菌株对饲喂高脂饲粮小鼠抗氧化功能的影响，从而为进一步明晰芽孢杆菌的抗氧化机理提供试验基础，也为相关活菌制剂的开发和应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

试验材料包括枯草芽孢杆菌B1制剂(浙江大学饲料科学研究所微生物与基因工程实验室制备，活菌数为108CFU/g)、普通ICR雄性小鼠、基础饲料(浙江大学试验动物中心提供)。

试验设备包括DK－8D恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)、5804R高速冷冻离心机(德国 Eppendorf公司)、T10 basic分散机(德国IKA公司)、SpectraMax M5多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计及饲养管理

将45只(35±1)g的ICR小鼠随机分为3组，每组3个重复，每个重复5只。分别饲喂基础饲粮(对照组)、高脂饲粮(5.0%猪油+2.0%胆固醇+0.2%胆盐+92.8%基础饲粮，高脂组)和高脂饲粮+0.1%(质量分数)枯草芽孢杆菌B1制剂(试验组)。每笼5只小鼠，定期更换垫料和饮水，自由采食、充足饮水，温度25℃，湿度55%，光照12 h/d，饲养 30 d。

1.2.2 样品收集与制备

饲养试验结束后，小鼠禁食不禁水12 h，每个重复随机挑选2只，乙醚麻醉，眼球采血。促凝采血管收集血液，37℃水浴2 h，4℃静置12 h，3 000 r/min离心15 min，吸取上层透明淡黄色液体(即血清)至1.5 mL离心管，－80℃冻存。小鼠采血后立即颈椎脱臼处死，解剖，取肝脏和小肠。清除小肠内容物后，纵向剖开，刮取内层黏膜。取肠黏膜和肝脏各0.5 g，按质量体积比1∶10加入预冷的0.9%生理盐水，在冰浴条件下进行充分匀浆，2 000 r/min离心 15 min，收集上清至1.5 mL离心管，－80℃冻存。

1.2.3 指标测定

测定血清、肠黏膜和肝脏抗氧化功能相关指标，如下:T－AOC、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、GSH－Px活性、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量、抗超氧阴离子自由基(superoxide anion radical，·)活性、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性、MDA 含量、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)活性、硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase，TrxR)活性、8 － 羟基脱氧鸟苷(8－hydroxydeoxyguanosine，8－OHdG)含量，其中8－OHdG含量仅针对组织匀浆样品。以上指标均使用试剂盒按操作说明书进行测定，T－AOC、SOD、GSH－Px、GSH、抗·、CAT、MDA、XOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所，TrxR和8－OHdG试剂盒购自上海拜力生物有限公司。

1.2.4 数据处理

试验数据以用平均值±标准差表示，采用SPSS 16.0软件中的one－way ANOVA过程进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌B1对高脂饲粮小鼠肠黏膜抗氧化功能的影响

由表1可知，3个组的小鼠肠黏膜抗氧化功能各有差异。与对照组相比，高脂组肠黏膜T－AOC减少了28.34%(P＜0.01)，CAT活性降低了7.26%(P＞0.05)，GSH含量升高了 49.86%(P＜0.01)，8－OHdG 含量增加了 9.42%(P ＞0.05);与高脂组相比，试验组肠黏膜 T－AOC和MDA含量分别增加了32.44%(P＜0.05)和50.00%(P＜0.01)，GSH－Px活性和GSH含量分别减少了48.58%(P＜0.01)和22.88%(P ＜0.05)，XOD 活性和8－OHdG含量也分别下降了18.42%(P＞0.05)和6.86%(P＞0.05)。上述结果提示，高脂饲粮可显著降低小鼠肠黏膜的T－AOC;添加枯草芽孢杆菌B1能显著提高高脂饲粮小鼠肠黏膜的T－AOC，显著降低部分抗氧化酶的活性。

表1 枯草芽孢杆菌B1对高脂饲粮小鼠肠黏膜抗氧化功能的影响Table 1 Effects of Bacillus subtilis B1 on antioxidant function in intestinal mucosa of mice fed a high－fat diet

2.2 枯草芽孢杆菌B1对高脂饲粮小鼠肝脏抗氧化功能的影响

由表2可知，3个组的小鼠肝脏抗氧化功能各有差异。与对照组相比，高脂组肝脏 SOD、GSH－Px、CAT、TrxR 活性和 T－AOC 分别降低了22.91%(P ＜0.05)、37.35%(P ＜0.01)、47.47%(P＜0.01)、36.42%(P＜0.05)和14.29%(P＞0.05)，8－OHdG含量显著增加了 67.87%(P＜0.01);与高脂组相比，试验组肝脏 GSH含量、CAT和TrxR活性分别提高了38.27%(P＜0.05)、53.01%(P＜0.05)和28.13%(P＞0.05)，T－AOC、MDA 与 8－OHdG 含量和 XOD 活性分别显著下降21.43%(P＜0.05)、16.01%(P＜0.05)、37.52%(P＜0.01)和16.25%(P＜0.05)。上述结果表明，高脂饲粮能降低小鼠肝脏抗氧化酶活性，增加8－OHdG含量;添加枯草芽孢杆菌B1能缓解高脂饲粮对小鼠肝脏的抗氧化能力的削弱，提高部分抗氧化酶活性和抗氧化物质含量。

表2 枯草芽孢杆菌B1对小鼠肝脏抗氧化功能的影响Table 2 Effects of Bacillus subtilis B1 on antioxidant function in liver of mice fed a high－fat diet

2.3 枯草芽孢杆菌B1对高脂饲粮小鼠血清抗氧化功能的影响

由表3可见，3个组的小鼠血清抗氧化功能均有所差异。与对照组相比，高脂组血清GSH含量、GSH－Px和抗·活性分别下降了30.73%(P＜0.01)、47.26%(P＜0.01)和8.02%(P＜0.01)，T－AOC 提高了 9.69%(P ＜ 0.05)，MDA含量上升了6.75%(P＞0.05)。与高脂组相比，试验组 血 清 T－AOC、GSH 含 量、GSH－Px 和 抗·活性分别提高了10.72%(P＜0.05)、38.01%(P ＜0.05)、51.98%(P ＜0.01)和13.45%(P＜0.01)，SOD活性显著下降了11.10%(P＜0.01)，MDA含量减少了8.85%(P＞0.05)。上述结果表明，饲喂高脂饲粮虽然提高了小鼠血清的T－AOC，但显著降低了多种抗氧化酶的活性和抗氧化物质的含量;而添加枯草芽孢杆菌B1能够显著增强高脂饲粮血清的T－AOC，并大幅提高大部分抗氧化酶活性。

表3 枯草芽孢杆菌B1对小鼠血清抗氧化能力的影响Table 3 Effects of Bacillus subtilis B1 on antioxidant function in serum of mice fed a high－fat diet

3 讨论

机体中清除自由基的系统包括抗氧化酶(SOD、GSH－Px、CAT 等)和非酶抗氧化剂(GSH、维生素C、维生素E等)，能捕捉和清除机体内的大部分过氧化物［6］。T－AOC是抗氧化物质的功能叠加，可作为衡量机体、器官或组织抗氧化功能的主要指标。小肠是营养物质消化吸收的主要场所，脂类在其中的乳化、水解及吸收均需要消耗能量，并产生大量自由基［7－8］。肝是机体进行脂肪代谢的主要场所，过量的脂肪摄入令肝细胞内丰富的线粒体产生大量的活性氧簇，导致脂质过氧化和肝脏抗氧化系统异常，进而引起脂肪性肝炎［9－10］。血液是机体运送营养物质和代谢产物的载体，其携带的自由基部分来源于血液中的细胞，部分来自其他器官、组织、细胞。近年研究表明，机体血液自由基水平增加，抗氧化能力下降，将导致血浆中的脂质发生过氧化损伤，并与动脉粥样硬化的发生发展密切相关［11］。因此，肠道、肝脏以及血液的抗氧化能力可较为全面地反映整个机体的抗氧化功能。本试验表明，高脂饲粮不同程度地削弱了小鼠肠黏膜、肝脏和血清的抗氧化功能，与前人的研究结果［12－15］相符。添加枯草芽孢杆菌B1能增强高脂饲粮小鼠肠黏膜、肝脏和血清的抗氧化功能，且效果血清＞肠黏膜＞肝脏。MDA是脂质过氧化的代谢产物之一，作为脂质过氧化程度的指标反映了机体的氧化应激水平［16］。8－OHdG被认为是氧化应激引起DNA氧化损伤的标志［17］。氧化应激状态的评价，应综合考虑氧化代谢产物水平和氧化损伤程度［6］。本试验结果表明，饲喂高脂饲粮可引起小鼠机体的氧化应激，且程度肝脏＞血清＞肠黏膜;枯草芽孢杆菌B1能降低高脂饲粮小鼠肠黏膜、肝脏和血清的氧化应激程度，效果肝脏＞血清＞肠黏膜，并减少肠细胞和肝细胞的DNA损伤。这提示枯草芽孢杆菌B1能通过减轻高脂引起的氧化应激状态，保护机体的抗氧化功能。由上可知，枯草芽孢杆菌B1在高脂饲粮小鼠肠黏膜、肝脏和血清中的作用方式各不相同，且抗氧化效果有所差异;该菌的抗氧化作用表现为增强和保护机体的抗氧化功能。

4 结论

①高脂饲粮降低了小鼠肠黏膜、肝脏和血清的抗氧化功能，并引起了不同程度的氧化应激。

②添加枯草芽孢杆菌B1对高脂饲粮小鼠的抗氧化功能具有一定的增强作用，并能减轻机体的氧化应激状态，较好地保护组织细胞免受氧化损伤。

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