红三叶异黄酮的提取方法和生理功能

朱宇旌 潘香岑 张 勇* 李欣蔚 马 勇 邵彩梅

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳 110866;2.辽宁禾丰牧业有限公司，沈阳 110164)

红三叶(red clover)又叫红车轴草、红荷兰翘摇，为豆科三叶草属多年生牧草。红三叶草在我国栽培广泛，总异黄酮含量丰富。红三叶异黄酮(red clover isoflavones，RCI)作为异黄酮类植物雌激素，在结构上与内源雌激素相似，能够与雌激素受体(ERs)、孕激素受体和雄激素受体以低亲和度结合而发挥弱雌激素样效应［1－2］。目前，食品和饲料工业中应用的异黄酮主要来自大豆，但红三叶各个部位异黄酮含量均高于大豆，且全株都可利用，成本比大豆低廉［3］，因而其开发利用日益受到人们的重视。RCI已经成为国内外继大豆异黄酮之后又一种研究较多的植物雌激素。

1 RCI的结构特征

RCI属于4’－甲氧基类异黄酮，需要在生物体内通过微生物酶系作用转化成具有双羟基结构以及活性更高的4’－羟基类异黄酮，从而更好地与雌激素受体结合，发挥植物雌激素作用［4］。目前红三叶中已经发现40多种异黄酮，可达干物质含量的1.5%～2.5%，其中主要的4种雌激素为芒柄花素、鹰嘴豆芽素A(鸡豆黄素A)、染料木素和大豆素(图1［5］)，其含量是其他植物无法与之相比的。其中芒柄花素和鹰嘴豆芽素A含量尤为高，而且是大豆中不存在的异黄酮类化合物［6］，因此具有很高的开发价值。RCI在新鲜的植物体内以糖苷的形式存在，在适宜的提取条件下发生水解或酶解，使大部分的糖苷转化成苷元，而苷元才是其真正的有效成分。

2 RCI的提取、纯化及鉴定

目前，RCI常用的几种提取方法主要有乙醇浸提、加压提取、碱水提取等。朱宇旌等［7］采用乙醇浸提法，结合超声波辅助提取红三叶中的总异黄酮，通过对提取剂乙醇浓度、提取温度、提取时间和料液比4因素3水平的正交试验，得出RCI的最佳提取工艺条件为:预浸时间8 h，乙醇浓度70%，料液比1∶25，提取温度70℃，提取时间1 h。在此条件下RCI的提取量为24.6 mg/g，粗提物得率为24.74%，粗提物纯度为5.99%。采用乙醇作为浸提液安全无毒，且价格低廉，可回收利用。杨薇薇等［8］采用加压提取工艺，当压力为0.8 MPa，乙醇浓度为 50%，料液比为 1∶15，保压时间为5 min时，红三叶草总异黄酮得率为57.0 mg/g，质量分数为8.85%。加压提取工艺与醇提法相比，是一种快速高效的新方法，但国内研究少见。吴三林等［9］采用碱水为浸提液，最佳提取工艺为:提取温度80℃，提取时间1 h，料液比1∶12，碱水 pH 为11，提取2次，总异黄酮提取率0.70%。该方法的优点是降低工艺成本，缺点是提取过程中有效成分可能被分解。

图1 红三叶异黄酮的结构式及组成Fig.1 Structure and composition of red clover isoflavones［5］

朱宇旌等［10］进一步对所提取的RCI采用大孔吸附树脂HPH 480进行了纯化，该工艺不仅吸附量大，而且解吸率高，适合其分离富集。动态吸附试验结果表明:RCI较好的动态吸附工艺参数为上样液浓度0.8～1.3 mg/mL，上样液pH为5，径高比1∶20，流速2 mL/min，室温下上样，采用70%乙醇室温洗脱，流速为1.0 mL/min，洗脱剂用量为4 BV，在此条件下得到的RCI纯度为25%以上，较粗提物提高4倍以上。采用树脂吸附法与溶剂萃取法联用对RCI进行精制以乙酸乙酯萃取效果较好，可使RCI纯度达到32.29%;采用树脂吸附法与重结晶法联用，纯度可达44.78%，但重复性差。

常平等［11］采用高效液相色谱法对红三叶草中4种主要异黄酮物质含量进行了鉴定，得出红三叶草中主要异黄酮物质含量分别为大豆黄素0.43% ～0.60%、染料木素0.35% ～0.64%、芒柄花素4.79%～9.29%和鹰嘴豆芽素A 1.32%～2.63%。

3 RCI的生理功能

RCI是一类具有营养作用和治疗意义的非固醇类物质，是目前国际上公认的安全有效的天然植物雌激素。RCI不仅在医学上具有提高机体免疫力、抗微生物、抑制炎症［12］、抗氧化和抗自由基形成［13］、强心降血脂、预防高血压［14］、控制焦虑症［15］等作用，而且适量应用于动物饲料还有促进动物生长、提高饲料利用率、改善畜产品品质、促进生殖系统发育、提高泌乳和繁殖力等作用，并且具有剂量小、见效快、无毒副作用等优点［16－17］。

3.1 RCI的雌激素与抗雌激素作用

RCI的4种主要成分均具有雌性激素作用，它们的特殊之处在于:1)几乎能分布到机体的每个细胞中去发挥作用，这是机体自身分泌的激素所不能达到的。2)具有双向调节作用，在机体内源性雌激素水平较低时表现为雌激素激动剂的作用;而当体内雌激素水平偏高时，它占据雌激素受体表现为抗雌激素作用。动物体内雌激素的内分泌调节存在3条途径:通过脑垂体产生的激素来调节雌激素的分泌;通过卵巢功能进行反馈性调节;通过一些生长因子和细胞因子进行调节。脑垂体能生成黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、卵 泡 刺 激 素 (follicle－stimulating hormone，FSH)、催乳素(prolactin，PRL)和促性腺激素释放激素(GnRH)等激素，其中LH对卵巢产生雄激素具有很强的刺激作用，成为内分泌调节的主要因素。

图2－A显示在繁殖期间，雌二醇的大量分泌会反馈给下丘脑，而后下丘脑神经递质的释放会引起GnRH以低频的脉冲形式进行释放。在下丘脑双向调节雌激素释放的过程中，α型雌激素是感受神经元释放神经递质的主要雌激素类型。当体内雌激素水平分泌过高时，RCI可占据雌激素受体，使体内分泌的过量的雌激素不能与受体结合，从而不能发挥作用。图2－B显示当雌激素分泌量减少时，同样会反馈给下丘脑，此时下丘脑神经递质的释放则会增加GnRH的释放频率。参与调节的神经递质同样是调节心率和体温的重要因子，因此这也是雌性激素减少以后会相应引起潮热和心率加快的原因。外源性添加RCI则可消除雌激素缺乏对下丘脑神经递质释放的反馈调节，因此，RCI可以缓解女性雌激素分泌量减少引起的潮热和心率加快症状。

图2 下丘脑-垂体-卵巢轴的神经内分泌系统调控回路Fig.2 The neuroendocrine circuit of the hypothalamo － pituitary － ovarian axis［18］

3.2 RCI的抗肿瘤作用

RCI可以降低乳腺癌的发病率。目前认为RCI的防癌机理在于RCI能优先与雌激素受体结合，抑制其循环转换成雌二醇类固醇的前体酶，抑制细胞信号途径的信号传递［19］。

肿瘤细胞的增殖受某些生长因子和雌二醇调控(图3)［19］。生长因子信号通过膜受体激活磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B(PI3－K/AKT)和丝裂原活化蛋白激酶的激酶－细胞外信号调节激酶1和2(MEK/ERK1/2)等细胞信号途径［20］。激活的雌二醇受体与这些信号途径相互作用，这一过程可能涉及膜关联雌二醇受体的参与［21－22］。相反，激酶信号途径可能激活细胞内的雌激素受体［23］。一些植物雌激素是细胞信号途径中的抑制因子，或者是雌激素受体的弱配体，例如染料木黄酮是酪氨酸激酶的抑制蛋白，而芹黄素则是PI3－K信号途径的抑制因子，因此植物雌激素可以抑制生长因子诱导的MEK/ERK1/2和PI3－K/AKT信号通路，抑制肿瘤的生长［24］。有研究表明，白藜芦醇能抑制Src酪氨酸激酶，同时，通过雌激素受体α(ERα)依赖型机制调节 PI3－K 信号途径［25］。尽管需要高剂量的使用上述植物雌激素才能达到抑制细胞信号途径的效果，但这些植物雌激素在调整癌细胞的生长方面可能会起到关键作用。

图3 红三叶异黄酮的抗肿瘤作用机制Fig.3 The antitumor mechanism of red clover isoflavones［19］

3.3 RCI的抗氧化作用

植物雌激素具有多个选择性雌激素受体调控元件的活性，可与转录因子如核转录因子 κB(NF－κB)相互作用，发挥抗氧化活性［26］。RCI的分子结构中含有多个酚羟基，因而具有抗氧化作用。RCI可作为自由基的供氢体，抑制自由基产生和消除自由基，保护机体内脂质、蛋白质、染色体免受活性氧的攻击，减少脂质过氧化物的产生和阻断脂质过氧化物的链式反应来发挥抗氧化作用。

天然抗氧化剂加强内源性抗氧化系统，以减少氧化应激产生中毒性疾病的危险［27］。消除自由基可以防御细胞免受其有害影响。多不饱和脂肪酸作为细胞膜的主要成分特别容易受到自由基的介导，因为其含有的共轭键结构，脂质过氧化过程会导致细胞膜结构和功能的紊乱［28］。人体中的活性氧和自由基是引发衰老、癌变和细胞损伤的重要原因。RCI能保护DNA不被氧化破坏，有效消除DNA的氧化损伤。羟自由基、超氧自由基清除试验及对猪油抗氧化试验表明，RCI有较强的消除羟自由基、超氧阴离子自由基和抑制脂质过氧化作用，且随添加量的增加，RCI抗氧化作用逐渐增强，当添加量达到4 mg/mL时，其抗氧化效果与0.02%的人工合成抗氧化剂2，6－二叔丁基对甲酚(BHT)相接近［29］。

3.4 潜在的抗病毒功能

大豆异黄酮中的染料木素可以抑制包膜或无包膜病毒，单链或双链DNA或RNA病毒的感染，包括腺病毒的感染、单一疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和轮状病毒，以减少它们动物的影响［30］。虽然RCI的抗病毒特性研究开展的不多，但因为RCI中主要成分也是染料木素，可以推测RCI具有抗病毒作用，但这还需要进一步研究证实。

3.5 RCI对雌激素受体转录活性的调节

图4显示一旦雌激素受体形成二聚体且配体结合到E/F结构域，雌激素受体即被活化，激素受体活化功能区1(AF－1)和活化功能区2(AF－2)就可以结合共调节因子。活化的雌激素受体既可以结合到DNA的雌激素效应元件(estrogen response element，ERE)上，也可结合到其他效应元件上，诸如活化蛋白 1(AP－1)和 I型类固醇因子(SF－1)。AF－2的转录过程在 ERα和雌激素受体 β(ERβ)这2种受体中比较类似。AF－1的转录活性在ERβ中很低甚至可以忽略。

图4 ERα和ERβ的结构与激活Fig.4 The structure and the activation of estrogen receptors α and β［19］

ERα和ERβ在不同基因上编码，类固醇受体的不同结构域表明这2种受体存在一定程度的同源性，同时，这2种受体的DNA连接结构域也具有高度的同源性，且配体连接E结构域也有60%的同源［31］。因此，雌激素对于 ERα 和 ERβ，具有相似的亲和力。由于这2种受体均具有2个活化功能区AF－1和AF－2，且这2个受体活化功能区一旦被激活，就可以结合基因转录调节因子，所以2种受体其C末端的AF－2的转录激活都依赖于配体结合。然而N末端AF－1的激活涉及到蛋白质间的相互作用，故在不存在任何雌性激素配体的情况下依然能够结合调节因子［32］。在此情况下，只有ERα可引起显著的转录激活。所以AF－1和AF－2 对 ERα 的促转录活性远大于 ERβ［33］。ERα的转录加强可阻断细胞生长因子信号转导通路，抑制癌细胞的生长［34］。RCI中的4种成分在机体中均可以发挥植物雌激素的作用，但RCI在机体内对2种受体的转录活性调节的机制还不清楚。

4 RCI对畜禽生长、免疫、繁殖和骨骼发育的影响

4.1 生长性能

RCI作为外源性弱的雌激素可与内源性雌二醇竞争下丘脑、垂体雌二醇受体，干扰性激素的正常反馈调节机能，使内源性激素水平提高或降低，进而使生长激素(GH)水平发生相应变化。而GH又通过胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF－Ⅰ)的介导，促进组织的生长和发育。饲粮中添加4.38 mg/kg RCI时，雄性肉鸡日增重提高了5.1%，料重比下降了9.2%，提高了饲料的利用率，说明RCI可能通过改变内源激素水平从而间接促进公鸡肌肉生长［35］。朱宇旌等［36］在肉鸡饲粮中添加 20 mg/kg RCI时，肉鸡整个生长阶段表现的生长性能显著优于对照组，肉鸡平均体增重提高6.86%。姜义宝等［37］也试验证明在肉鸡饲粮中添加20 mg/kg RCI时促生长效果较好，认为RCI可通过调节体内GH、IGF－Ⅰ、三甲状腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4)水平来影响肉鸡的生长性能。但RCI对动物的生长具有双向作用，添加量过多，生长性能反而呈现降低的趋势。在肉鸡饲粮中添加5～20 mg/kg RCI时，肉鸡平均体增重随添加剂量的增加而提高，当RCI添加量达到30 mg/kg时，肉鸡的平均体增重、耗料量和料重比呈现下降的趋势。因此，高剂量的RCI不仅不会促进动物生长，反而抑制其生长［37］。

4.2 免疫功能

RCI对动物免疫功能具有增强和抑制的双向调节作用，对机体的细胞、体液及非特异性免疫功能有不同程度的影响。目前认为雌激素对免疫的调节作用是通过位于免疫器官或免疫细胞上的雌激素受体而发挥作用的。异黄酮直接作用于免疫器官(如胸腺)或各种免疫细胞上的雌激素受体，调节机体免疫功能，并且存在剂量效应。

张勇等［38］试验表明，适量的RCI提取物能够促进免疫器官的发育，且对胸腺系数的影响呈剂量依赖效应;RCI促进小鼠非特异性免疫功能，较高剂量的RCI使小鼠血清溶血水平明显上升，同时激发了小鼠迟发性变态反应。饲粮中添加RCI能显著增加肉鸡免疫器官法氏囊重，并显著提高血清总蛋白和球蛋白含量。饲粮中添加20 mg/kg RCI显著提高了产蛋后期母鸡脾脏指数(较对照组提高了61.6%)［39］。在研究中我们还发现，RCI具有明显的双向调节作用，在低剂量时表现出对生长免疫的促进作用，但高剂量时却表现为抑制作用［40］。免疫抑制效应在临床上的意义表现在:一方面，免疫抑制对自身免疫性疾病有积极的影响;另一方面，在感染的防御过程中，RCI可减少有机体对免疫反应产生的不利影响。从细胞生物学和动物试验得出的证据表明，雌激素对免疫系统有重要的影响。人类疾病如自身免疫性类风湿关节炎，自身免疫性肾小球性肾炎，甚至恶性疾病如白血病均与雌激素分泌有关［18］。

4.3 繁殖性能

RCI对动物的生殖器官具有一定的影响。有研究表明摄入RCI的母羊，体内各器官的异黄酮含量分布肾中最高，卵巢、子宫含量居中［5］，提示RCI对动物生殖性能有一定影响。红三叶草中的提取物已被证明能抑制芳香酶活性，抑制炎症发生［41］。动物研究表明，RCI影响机体的生殖发育，当给予高剂量的大豆素和染料木素，青春期大鼠在子宫有调节性激素受体基因的表达［42］。另外，RCI还可改善去卵巢大鼠的子宫萎缩状况，发挥一定的雌激素作用［43］。

4.4 骨骼发育

RCI与动物的骨吸收及骨代谢密切相关。动物体内雌激素的分泌随着年龄的增长而降低，由于雌激素水平的下降，体内骨代谢平衡破坏，使骨吸收大于骨形成，骨量逐渐减少，导致骨质疏松症的发病率增高。而RCI能够与雌激素受体以低亲和度结合而发挥雌激素样效应［44］，可抑制骨吸收，减少骨丢失，有效预防骨质疏松症的发生。饲料中随着RCI添加水平的提高，血清钙含量呈升高趋势，添加20 mg/kg RCI可显著提高产蛋后期鸡的胫骨灰分含量［37］。通过对去卵巢大鼠研究发现，RCI高剂量组的骨密度、骨矿物质元素含量均显著高于模型组，接近于雌激素组，低剂量组则没有效果，说明RCI在一定剂量下可通过抑制破骨细胞的发育和分化，维持骨密度值处于相对稳定的水平，增加其骨质量，从而达到防治骨质疏松症的目的［45］。

5 小结

红三叶草中主要含异黄酮的活性成分包括大豆黄素、染料木素、芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A。RCI同时具有雌激素与抗雌激素作用，可调控雌激素受体转录，还具有体内抗氧化作用。畜禽饲料中合理利用可提高其生产性能，改善畜禽健康水平，提高繁殖性能，促进骨骼发育。尽管RCI在畜禽生产中发挥作用的机理仍需进一步深入研究，但因其安全无毒、添加量少、效果显著，在动物营养领域的研究中日益受到关注，是一种极具开发前景的新型绿色饲料添加剂。

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