链霉菌YIM 245次生代谢产物的研究

靳荣线，曹艳茹，2，苗翠苹，李文均，姜 怡* ，吴少华*

1云南大学云南省微生物研究所西南微生物多样性教育部重点实验室，昆明 650091;2西北农林科技大学资源环境学院，杨凌 712100

从经典的抗生素筛选到当今借助微生物基因组学、宏基因组学等手段辅助药物筛选，放线菌在天然产物的产生与筛选中都占有重要位置。所以，探寻新型放线菌资源、改善分离方法和提高未知放线菌的出菌率一直是放线菌研究的重要内容。放线菌具有丰富的生物多样性，其天然产物有着广泛的生物学活性，是发现具有生物活性新型次生代谢产物的重要资源［1］。

随着药物研发水平的进步，对先导化合物的发现也不再局限于陆生植物。相对于植物内生放线菌，对动物肠道放线菌的研究发展较快，特别是对昆虫共生放线菌的研究［2-4］。本实验室从2007年开始对西南特有几种动物的粪便放线菌进行研究，并对从中得到的一些有生物活性的菌株进行代谢产物的初步研究［5］。

菌株YIM 245为从长颈鹿粪便中分离得到的一株放线菌，通过对其培养特征和16S rRNA基因序列分析，属于链霉属(Streptomyces sp.)。抗菌活性检测显示该菌株的发酵产物具有较强的抗菌活性。因此，我们进一步对其发酵产物的化学成分进行了研究，从发酵提取物中分离得到7个化合物。依据理化性质及波谱数据分析，分别鉴定为2'-脱氧胞嘧啶核苷(1)、2'-脱氧胸苷(2)、2'-脱氧尿苷(3)、2’-脱氧腺苷(4)、菜油甾醇(5)、大豆素(6)和邻氨基苯甲酸(7)，7个化合物均显示较弱的抗菌活性。

1 材料和方法

1.1 发酵菌株

菌株YIM 245从长颈鹿粪便中分离得到，经纯培养后，以38#琼脂斜面保存在4°C。

1.2 指示菌株

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，白色念珠菌(Candida albicans)，大肠杆菌(Escherichia coli)，黑曲霉菌(Aspergillus niger)。

1.3 培养基

38#:葡萄糖4 g，酵母膏4 g，麦芽膏5 g，复合维生素微量(3.7 mg)，微量盐1 mL，琼脂13 g，蒸馏水1000 mL，pH7.2

302#:甘露醇20 g，大豆 20 g，蒸馏水1000 mL，pH7.8

LB:胰蛋白胨10 g，氯化钠5 g，酵母膏5 g，蒸馏水 1000 mL，pH7.2

PDA:土豆200 g，葡萄糖10 g，蒸馏水1000 mL，pH自然

1.4 仪器与试剂

仪器:超净工作台(AirTech);隔水式电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械厂);高速台式离心机(上海医用分析仪器厂);SHI-22型水浴恒温振荡器(江苏太仓医疗器械厂);电子天平(中山市新和科技开发有限公司);紫外灯(Shimadzu);Bruker DRX-500型超导核磁共振仪;Agilent G3250AA LC/MSD TOF型质谱仪;EYELA旋转蒸发仪。

试剂:反相硅胶RP-18(Merck)，Sephadex LH-20(Pharmacia)，薄层层析用硅胶G板和柱层析硅胶200～300目(青岛海洋化工厂);其他试剂均为分析纯。

1.5 发酵液的制备

种子液制备:从新鲜斜面培养基中将菌株转接到装有100 mL 38#培养基的500 mL锥形瓶中，于28℃、200 rpm摇床培养2 d。

将种子液转接到装有100 mL 302#培养基的500 mL锥形瓶中相同条件下摇床培养7 d，共获得发酵产物40 L。

1.6 提取分离

发酵产物经4500 rpmn离心10 min得到发酵液和菌丝体，发酵液经大孔树脂HP-20吸附和乙酸乙酯萃取后减压浓缩，菌丝体经95%乙醇浸泡后减压浓缩，根据TLC检测，合并发酵液和菌丝体粗体物共140 g。发酵粗提物经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，得到6个组分。组分1经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(95∶5)洗脱得化合物6(5 mg)。组分2经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(4∶1)洗脱得化合物2(8 mg)。组分3(5 g)经硅胶柱层析，用石油醚-丙酮(7∶3)洗脱，再经凝胶Sephadex LH-20柱层析，用甲醇洗脱得化合物3(3 mg)。组分3经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(9∶1)洗脱得化合物4(3 mg)。组分4经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(95∶5)洗脱得化合物5(4 mg)。组分6经硅胶柱层析，用氯仿-丙酮(9∶1)，再经 RP-18 反相柱层析，用甲醇-水(5∶95)洗脱得化合物7(5 mg)。组分7经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(3∶1)洗脱得化合物1(2 mg)。

1.7 化合物的抑菌活性检测

在长有指示菌的固体斜面培养基中加入1 mL无菌水，震荡片刻制成指示菌悬液。将化合物1～7分别溶解于50%DMSO的水溶液中，配制成浓度为800(g∕mL的母液，用LB和PDA液体培养基将样品分别倍比稀释为八个浓度:800、400、200、100、50、25、12.5、6.25(g ∕ mL.按每孔 50 μL 将它们分别加入到96孔板中，再向每孔中加入50 μL活性指示菌菌悬液。以100(g∕ mL制霉菌素和青霉素为阳性对照，加入等体积PDA液体培养基的孔为阴性对照，不加菌液的孔为空白对照。上述每组样品设置3个平行处理。将96孔板置于28℃培养箱中培养24 h后，肉眼观测活性指示菌的生长状况，以没有指示菌生长的目标产物的最低浓度为最小抑菌浓(MIC)。

2 结果与分析

2.1 化合物的结构鉴定

化合物1 白色固体;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:8.06(1H，d，J=7.4 Hz，H-6)，6.29(1H，t，J=6.1 Hz，H-1’)，5.94(1H，d，J=7.2 Hz，H-5)，4.38(1H，m，H-4’)，3.96(1H，m，H-3’)，3.82(1H，dd，J=11.8，3.0 Hz，H-5’a)，3.75(1H，dd，J=11.8，3.6 Hz，H-5’b)，2.38(1H，m，H-2’a)，2.16(1H，m，H-2’b);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:168.6(C-4)，158.5(C-2)，144.7(C-6)，98.6(C-5)，89.3(C-4’)，88.0(C-1’)，73.4(C-3’)，63.4(C-5’)，42.4(C-2’)。以上数据与文献对照一致［6］，故鉴定为2'-脱氧胞嘧啶核苷。

化合物2 白色晶体;1H NMR(Pyridine-d5，500 MHz)δ:8.13(1H，s，H-6)，7.01(1H，t，J=5.5 Hz，H-1’)，5.01(1H，m，H-4’)，4.45(1H，m，H-3’)，4.22(1H，d，J=11.7 Hz，H-5’a)，4.13(1H，d，J=11.7 Hz，H-5’b)，2.65(2H，m，H-2’)，1.98(3H，s，CH3);13C NMR(Pyridine-d5，125 MHz)δ:165.8(C-4)，152.7(C-2)，137.5(C-6)，111.3(C-5)，89.6(C-4’)，86.2(C-1’)，72.3(C-3’)，63.1(C-5’)，42.2(C-2’)，13.5(5-CH3)。以上数据与文献对照一致［7］，故鉴定为2'-脱氧胸苷。

化合物3 白色晶体;1H NMR(Pyridine-d5，500 MHz)δ:8.34(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.96(1H，t，J=6.5 Hz，H-1’)，5.80(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，4.99(1H，m，H-4’)，4.46(1H，m，H-3’)，4.19(1H，d，J=11.7 Hz，H-5’a)，4.11(1H，d，J=11.7 Hz，H-5’b)，2.69(1H，m，H-2’a)，2.58(1H，m，H-2’b);13C NMR(Pyridine-d5，125 MHz)δ:166.0(C-4)，153.4(C-2)，142.4(C-6)，104.0(C-5)，90.5(C-1’)，87.1(C-4’)，72.9(C-3’)，63.8(C-5’)，43.1(C-2’)。以上数据与文献对照一致［7］，故鉴定为2'-脱氧尿苷。

化合物4 淡黄色粉末;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:8.40(1H，s，H-8)，8.18(1H，s，H-2)，6.45(1H，m，H-1’)，4.61(1H，m，H-3’)，4.10(1H，m，H-4’)，3.80(1H，m，H-5’a)，3.78(1H，m，H-5’b)，2.85(1H，m，H-2’a)，2.81(1H，m，H-2’b);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:157.9(C-6)，153.9(C-2)，150.3(C-4)，141.9(C-8)，121.2(C-5)，90.3(C-1’)，87.5(C-4’)，73.4(C-3’)，64.0(C-5’)，41.9(C-2’)。以上数据与文献对照一致［7］，故鉴定为2'-脱氧腺苷。

化合物 5 白色粉末;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.38(1H，brs，H-6)，3.57(1H，m，H-3)，1.04(3H，s，H-19)，0.94(3H，d，J=6.7 Hz，H-28)，0.90(3H，d，J=6.7 Hz，H-21)，0.84(3H，d，J=6.5 Hz，H-26)，0.79(3H，d，J=6.7 Hz，H-27)，0.70(3H，s，H-18);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:141.2(C-5)，122.0(C-6)，72.2(C-3)，56.6(C-8)，56.5(C-9)，42.7(C – 14)，40.2(C-17)，37.6(C-4)，36.9(C-6)，32.5(C-1)，32.3(C-20)，32.1(C-2)，30.0(C-11)，29.7(C-24)，29.4(C-25)，28.6(C-12)，26.6(C-15)，24.7(C-16)，23.5(C-22)，21.6(C-12)，21.5(C-23)，20.1(C-19)，19.7(C-21)，19.4(C-24)，19.3(C-28)，19.1(C-27)。以上数据与文献对照一致［8］，故鉴定为菜油甾醇。

化合物6 淡黄色晶体;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:10.79(1H，s，H-7)，9.55(1H，s，H-4’)，8.26(1H，s，H-2)，7.98(1H，d，J=8.6 Hz，H-5)，7.39(2H，d，J=7.9 Hz，H-2’，6’)，6.94(1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，6.86(1H，s，H-8)，6.83(2H，d，J=7.9 Hz，H-3’，5’);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:175.0(C-4)，162.8(C-7)，157.8(C-9)，153.1(C-2)，130.8(C-2’)，130.4(C-6’)，127.6(C-5)，123.8(C-1’)，122.9(C-3)，117.0(C-10)，115.8(C-6)，115.4(C-3’)，115.3(C-5’)，102.4(C-8)。以上数据与文献对照一致［9］，故鉴定为大豆素。

化合物7 淡黄色晶体;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.83(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.25(1H，td，J=8.0，1.4 Hz，H-3)，6.75(1H，d，J=8.3 Hz，H-2)，6.58(1H，t，J=8.0 Hz，H-4);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:172.0(C-7)，153.2(C-1)，135.4(C-3)，133.0(C-5)，118.1(C-4)，117.0(C-2)，112.2(C-6)。以上数据与文献对照一致［10］，故鉴定为邻氨基苯甲酸。

图1 化合物1～7的化学结构Fig.1 The structures of compounds 1-7

2.2 化合物的抑菌活性结果

采用96孔板法测定了化合物1～7对5种病原指示菌的抑菌活性，结果均显示较弱的抑菌活性(见表1)。

3 讨论

本研究从非洲特有动物长颈鹿的粪便环境中分离得到一株放线菌YIM 245，经16S rRNA基因序列初步分析，其属于链霉菌属。从该菌株的发酵产物中分离获得了7个化合物，均为首次从该动物粪便极端生境中分离获得到，本研究为微生物资源的挖掘及代谢产物的分离提供一条新途径。抗菌实验结果表明，7个化合物均显示较弱的抑菌活性。在研究过程中由于某些代谢产物的含量较低、成分复杂，不能进行有效的分离和结构鉴定，今后还需对其中的微量成分进一步深入研究，提高动物粪便环境中放线菌资源及其活性代谢产物的开发与应用。

表1 化合物1～7的抑菌活性Table 1 The antimicrobial activities of compounds 1-7

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