人工养殖暹罗鳄血清血浆及白细胞提取物体外抗菌活性研究

崔小冬，欧阳召，王春梅，赓 迪

北京中医药大学中药学院生物制药系，北京 100102

随着鳄鱼人工养殖的成功，其价值得到多方面的开发，包括旅游观赏、餐饮加工、时装皮具等，自1999年Sharbanay报道海水鳄血清有抗菌活性以来，国外、国内已有多位学者对不同种鳄鱼的血浆、白细胞等进行了抗菌抗病毒方面的研究［1-7］，结果显示鳄鱼血清或白细胞对部分革兰氏阳性菌(G+)、革兰氏阴性菌(G-)有抑制效果，如链球菌、大肠杆菌、志贺杆菌、绿脓杆菌等。其中泰国科学家研究发现暹罗鳄新鲜血清能抑制革兰氏阴性菌包括产气肠杆菌ATCC 13048、大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 27736、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311和铜绿假单胞菌ATCC 27853，也抑制新型隐球菌250309和黑曲霉，然而不抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、白色念珠菌(C.albicans)和隐球菌(C.neoformans)［8］。暹罗鳄白细胞提取物能够抑制绿脓杆菌(Psudomonas aeruginosa)、伤寒杆菌(Salmonella typhi)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、表皮葡萄球菌(Staphylococus epidermidis)和白色念珠菌(Candida albicans)［9］。那么，人工养殖的暹罗鳄血是否具有抗菌活性呢?本实验从以上文献结论出发选取G-大肠杆菌、绿脓杆菌;G+金黄色葡萄球菌进一步验证人工养殖暹罗鳄血样品的抗菌效果，另外选取白色念珠菌来观察其对真菌是否有作用，为进行鳄鱼血抗菌方面产品开发提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 鳄鱼血的来源

人工养殖暹罗鳄(Crocodylus siamensis)血来源于海南三亚龙虎园养殖场，有林业局批准的野生动物驯养繁殖许可，由北京洪源澳达投资有限公司提供。取血方法为活体固定后窦动脉取血，鳄鱼不进行麻醉。

1.1.2 菌株来源和培养

大肠杆菌 (Escherichia coli DH5α)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色念珠菌(Candida albicans)购自中科院微生物研究所菌种室。大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的培养选用LB培养基，白色念珠菌选用牛肉膏蛋白胨培养基，固体培养基含1.2%的琼脂。上述LB、牛肉膏蛋白胨固体培养基适于纸片法、平板菌落计数法，打洞法所用培养基在高压灭菌并冷却至45～50 ℃［1，9］，加入不同菌种不同浓度菌液后定量倒入平皿制成。

1.2 方法

1.2.1 鳄鱼血成分的制备方法

1.2.1.1 鳄鱼血清的制备方法

获得的鳄鱼血液，盛于离心管中，静置促其凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心(3000 rpm，10 min)，得到的上清液即为血清，可小心将上清吸出(注意切勿吸出细胞成分)，分装备用。第一个浓度为原液，第二个浓度为2倍稀释，第三个浓度为4倍稀释，以生理盐水稀释。

1.2.1.2 鳄鱼血浆的制备

在盛血的离心管中先加入一定比例抗凝剂溶液(3.2%枸橼酸钠)，再将血液加入(抗凝剂溶液:血液 =1∶9)后，立即连续摇动，充分混合，配平后离心(离心3000 rpm，离心5～10 min)，所得的上清液即为血浆［10］。血浆浓度第一个浓度为原液，后两个稀释浓度同血清，沉淀用于制备白细胞提取物。

1.2.1.3 鳄鱼血白细胞提取物的制备方法

用生理盐水洗涤离心制备血浆后的沉淀一次，倒尽上清液，恢复至4 mL，即为全血细胞悬液(包括红细胞和所有白细胞)。白细胞悬液制备:取0.2 mL全血细胞悬液，加蒸馏水2 mL，在冰水中轻轻吹打1 min，再加1.8%氯化钠溶液2 mL，混匀，再加生理盐水至满，离心沉淀，弃上清液，即为0.2 mL的白细胞悬液［11］。超声波破碎悬液中的白细胞，并加入等体积10%的乙酸溶液，4℃下震荡(250 rpm)2 h，低温高速离心收集上清液，真空冷冻干燥，用0.01%醋酸溶液溶解即为白细胞提取物［9］。用Bradford法测定白细胞提取物的总蛋白含量。牛血清白蛋白标准品用于制作标准曲线。第一个样品浓度为总蛋白200 μg/mL，后2个浓度为倍比稀释浓度，同血清，血浆。

1.2.2 鳄鱼血成分的抑菌实验方法

氨苄西林钠50 ug/mL溶液作为抗金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的阳性药;青霉素、链霉素的双抗溶液作为抗大肠杆菌的阳性药;称取一定量的达克宁膏剂，加入三倍量的注射用水稀释成乳剂作为抗白色念珠菌的阳性药。血清与血浆的空白对照为生理盐水，白细胞提取物的空白为0.1%乙酸溶液。

1.2.2.1 纸片法

将固体斜面保存菌种接入液体培养基进行活化，置震荡培养箱37℃培养18～24 h至吸光度值达 0.5 左右(细菌测 OD600，真菌测 OD595)［1，9］，得新的增菌液;药敏纸片的制备:通过打孔器将定性滤纸制成6 mm的圆片，经高压灭菌烘干备用。每纸片分别滴上鳄鱼血清、血浆、白细胞提取物、阳性对照药液以及相应空白对照5 uL，超净台里风干待用;将菌液150 uL加到LB固体平板上，用无菌不锈钢涂布棒涂布均匀，将三个不同浓度的鳄鱼血组分样品的风干药敏纸片、阳性及空白纸片贴于同一菌培养基平板上，倒置，37℃培养18～24 h，观察细菌生长情况，测量抑菌环，每个成分的每个浓度设置3个重复，取平均值。

1.2.2.2 打孔法

将LB培养基高压灭菌并冷却至45～50℃，将298 mL培养基与2 mL增菌液在灭菌烧杯中充分混匀，用无菌玻璃注射器迅速抽取30 mL含菌培养基，注入直径为9 cm的平皿中，接种针挑破气泡，静置使凝固［9］;用内径为5 mm立式打孔器打孔至底部，平皿中心打一孔，距边缘对称打四孔，用洗耳球将孔中固体吸出;分别取三个不同浓度的鳄鱼血组分、阳性及空白溶液30 uL(白细胞提取物含总蛋白200 μg/mL)加入到同一含菌培养基平板上的5个洞中，待液体扩散后倒置，37℃培养18～24 h，观察细菌生长情况，测量抑菌环，每个成分的每个浓度设置3个重复，取平均值。

1.2.2.3 平板计数法［1］

取不同菌株16～18 h的增菌液，用无菌生理盐水调其吸光度值为0.5，记为100，取100菌液30 uL加入到270 uL无菌生理盐水中，混匀为10-1，倍比稀释至10-7。取1.5 mL无菌离心管，每管分别加入400 uL生理盐水后，各组每管分别对应加入50 uL血清、血浆、白细胞提取物、空白对照、阳性药溶液混匀，置震荡培养箱37℃ 培养1 h，将管中混合液加到LB固体平板上，用无菌不锈钢涂布棒涂布均匀，倒置，37℃ 培养18～24 h观察结果，统计各样品对各菌株各浓度菌液存活百分率，每个浓度设置3个重复，取平均值。

1.2.3 统计处理

2 结果

本研究采用三种常用的检测样品抗菌活性的方法:纸片法，打孔法和菌液稀释平板计数法。在纸片法和打孔法的测试中所有样品对所有菌种都不表现出抗菌活性，阳性对照药表现出很好的抗菌活性，结果见表1。

表1 纸片法测定鳄鱼血清血浆及白细胞提取物对四种菌的抑菌环直径大小(mm)Table 1 Inhibition effects of the crocodile serum plasma and white blood cell extracts on the four kinds of microbe by the paper disk diffusion method(mm)

由于打孔法和纸片法均为阴性结果，本文以下数据为通过平板计数法获得，检测了鳄鱼血清对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制效果。

2.1 鳄鱼血液组分对大肠杆菌的抑制效果

采用菌液稀释平板计数法分别检测鳄鱼血清、血浆和白细胞提取物对大肠杆菌的抑制作用，以青霉素和链霉素的双抗作为阳性对照。结果表明鳄鱼血清和血浆有一定的抑制大肠杆菌生长的效果，血清效果强于血浆，但程度较阳性药弱(见表2)。

表2 鳄鱼血液各组分对大肠杆菌不同浓度菌液存活百分率(%)的影响Table 2 Effects of samples on livability(%)of Escherichia coli DH5α

2.2 鳄鱼血液组分对金葡菌的抑制效果

采用菌液稀释平板计数法分别检测鳄鱼血清、血浆和白细胞提取物对金葡菌的抑制作用，以青霉素作为阳性对照。结果表明鳄鱼血清血浆和白细胞提取物都有一定的抑制金葡菌生长的效果，样品中抑制程度以白细胞提取物效果最好，其次是血清样品，但程度仍然较阳性药弱(见表3)。

表3 鳄鱼血液组分对各金葡菌不同浓度菌液存活百分率(%)的影响Table 3 Effects of samples on livability(%)of Staphylococcus aureus

本实验室采用菌落平板计数法还检测了鳄鱼血清、血浆及白细胞提取物对绿脓杆菌和白色念珠菌的抑制效果，结果表明鳄鱼的血液组分对这两种菌均无作用。

3 讨论

本实验采用三种抑菌试验方法进行活性检测，结果发现通过纸片法多次重复性实验及阳性对照实验，显示鳄鱼血的血清、血浆和白细胞提取物对以上四种菌无明显的抗菌能力，其原因可能是抗菌成分为大分子类，被纸片吸附后无法扩散出去抑制菌类产生抑菌环。经打洞法验证，鳄鱼血清、血浆和白细胞提取物也无明显抗菌效果，可能是打洞法作为纸片法的衍生方法，去除了纸片对液体成分的吸附，但大分子仍无法穿越孔四周的琼脂层而出现抑菌现象。用菌落计数法发现鳄鱼血的血清和血浆对大肠杆菌和金葡菌有抑制作用，鳄鱼血白细胞提取物对金葡菌有一定抑制作用。抑菌实验方法的选择对实验结果影响很大，对于含蛋白类抗菌成分的活性测定较适宜的方法采用菌落计数法较好。

本实验室的结果与文献报道有差别，邹黎黎等［2］试验结果证明来源于广州市番禺香江野生动物鳄鱼公园的暹罗鳄血白细胞提取物可以抑制金葡菌和大肠杆菌的增殖，本实验室所制备的白细胞提取物对金葡菌有抑制作用，但对大肠杆菌无效。国外学者［5］对暹罗鳄白细胞提取物的抗菌活性筛选结果是白细胞提取物能够抑制金葡菌的生长，不能抑制大肠杆菌和绿脓杆菌生长，与本实验室结果一致，另外，他们发现白色念珠菌对鳄血白细胞提取物敏感［5］，本实验室样品不具有对白色念珠菌的抑制活性。各个实验室的结果存在差异的原因可能是样品来源不同(本实验室的鳄鱼血为活体取血所得，并没有对鳄鱼进行麻醉，这与多数实验室的取血方式不同)，处理方式不同(血细胞的制备方法稍有差别，本实验采用收集全血细胞后破裂红细胞的方法得到白细胞，邹黎黎［2］等直接从血液中取白膜层状细胞制备白细胞)，抗菌有效成分未保留到相应的组分中或已经被破坏无法复性;别的原因可能是抗菌成分是补体系统［12］激发的，该动物体内通常不含大量的强抗菌成分，取样时也未大量产生。

虽然鳄鱼血中含有抗菌成分，但本研究表明鳄鱼血的多成分混合液抗菌活性弱于阳性对照，另外，鳄鱼血的抗菌活性具有热不稳定、温度依赖性、对蛋白酶敏感等特点［7］，如果鳄鱼血不经纯化直接制备成抗菌产品，可能没有意义。目前国外仍在深入研究鳄鱼血的抗菌活性成分，最近，他们利用反相高效液相色谱的方法从白细胞提取物中分离得到四种抗菌肽，抗菌活性远远高于粗提物，研究仍在进行［13-15］，最终有可能将来通过基因工程生产。

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