蛹虫草子实体中甘露醇含量的测定

刘艳芳，薛俊杰，2，张劲松，杨 焱，周 帅，冯娜，汪雯翰，吴 迪，张 忠，唐庆九*

1国家食用菌工程技术研究中心上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201403;2南京农业大学生命科学学院，江苏南京 210095

蛹虫草又名北虫草、北冬虫夏草，属于子囊菌亚门(Ascomycotina)，麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps)的模式种，学名为Cordyceps militaris，是一种常见的食药用真菌［1，2］，2008 年被国家卫生部批准为新资源食品后备受关注。甘露醇是其活性成分之一，具有利尿脱水、镇咳、祛痰、平喘等多种功效［3］。甘露醇含量的高低已成为虫草产品的质控指标之一。

目前用于甘露醇测定的方法主要有化学比色法［4］、气相色谱法［5］、高效液相色谱法［6-7］等，化学比色法易受干扰，测定结果不准确;气相色谱法需要衍生化，处理复杂。HPLC是目前理想的快速、准确测定甘露醇的方法。但用于测定甘露醇的HPLC分析柱多为氨基柱，由于氨基柱存在氨基基团从硅胶表面缓慢地漂移等问题，使用寿命有限，因此本研究使用一种配位体型分析柱，开发了分析测定甘露醇的新方法，并进行了方法学考察，为蛹虫草中甘露醇的定量分析提供了保证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源

蛹虫草子实体，购自上海百信生物科技有限公司。

1.1.2 试剂

甘露醇标准品购自sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

Waters600型高效液相色谱仪，Waters2414示差折光检测器;Dionex ICS2500离子色谱分析仪;ELGA超纯水制备仪。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件的优化

选用Shodex公司SUGAR SP0810柱(300 mm×8 mm)为分析柱，以超纯水为流动相洗脱，示差折光检测器检测，对流速及柱温等条件进行优化，确定色谱分析条件。

1.2.2 样品前处理方法的优化

根据分析柱的特性，对提取溶剂、提取方式、提取时间等条件进行优化，确定样品前处理方法。

1.2.3 标准曲线的绘制

精密称取烘至恒重的甘露醇标准品500 mg，置于10 mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度作储备液。将储备液稀释至不同浓度，进样分析甘露醇，根据峰面积和甘露醇含量绘制标准曲线。

1.2.4 蛹虫草子实体中甘露醇含量的计算

根据样品对应甘露醇的峰面积和标准曲线，计算样品中甘露醇含量。

1.2.5 不同方法测定蛹虫草子实体中甘露醇含量的比较

取同一批样品，分别用化学比色法［4］、离子色谱分析法［8］及本方法测定其甘露醇含量，比较测定结果的准确性。

2 结果与分析

2.1 色谱分析条件

根据SUGAR SP0810分析柱的性能，选用超纯水为流动相洗脱，对分离温度及流速进行了优化，发现柱温为70～80℃时样品中甘露醇峰形及分离度较好;另外，随着洗脱流速的增加，甘露醇保留时间提前，分析时间缩短，因此在保证分离度的前提下选定1.0 mL/min的流速洗脱。标准品图谱及样品分析图谱如图1所示。

图1 标准品与样品高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard and sample

2.2 样品前处理方法的优化

2.2.1 提取溶剂的比较

精密称取蛹虫草子实体粉1 g，分别加入80%乙醇、90%乙醇和无水乙醇各100 mL热回流提取1 h，过滤去除菌粉沉淀，上清旋转蒸发仪回收乙醇后加水至50 mL混匀，样品液经0.45 μm膜过滤后进行HPLC测定，分析提取量，每个处理重复3次(下同)。由表1结果可以看出，随着乙醇浓度的增加，对甘露醇的提取率降低，无水乙醇对甘露醇的溶出效果较差，80%乙醇与90%乙醇做为提取剂对甘露醇的提取量没有显著差异(P＜0.05)，根据分析柱特性，为了尽量减少溶液中蛋白质对柱子的影响，选择以90%乙醇做为提取溶剂进行提取。

表1 提取溶剂对蛹虫草子实体甘露醇提取量的影响(n=3)Table 1 Contents of mannitol extracted from fruiting bodies of Cordyceps militaris with different extraction solvents(n=3)

2.2.2 提取溶剂体积的筛选

精密称取蛹虫草子实体粉1 g，分别加入90%乙醇50、100、150和200 mL热回流提取1 h，按上述2.2.1处理方法处理后分析甘露醇提取量。由表2结果可知，提取溶剂增加到150 mL时，提取所得甘露醇含量最高，增加到200 mL时，甘露醇含量没有显著变化，因此选择在1 g子实体中加入150 mL的90%乙醇提取。

表2 提取溶剂体积对甘露醇提取量的影响(n=3)Table 2 Contents of mannitol extracted with different volume of extraction solvents(n=3)

2.2.3 提取方式的优化

精密称取蛹虫草子实体粉1 g，加入90%乙醇150 mL后分别进行热回流提取和超声波提取1 h，按2.2.1处理方法处理后分析甘露醇提取量。表3结果显示，不同提取方式对甘露醇的提取效果差异较大，热回流方式对甘露醇的提取较为充分，提取率明显优于超声波提取，因此选用热回流方式进行样品前处理。

表3 提取方式对甘露醇提取量的影响(n=3)Table 3 Effects of extracting modes on the contents of mannitol(n=3)

2.2.4 提取时间的优化

精密称取蛹虫草子实体粉1 g，加入90%乙醇150 mL 后分别热回流提取 0.5、1、1.5 和 3h，按2.2.1处理方法处理后分析甘露醇提取量。表4结果显示，热回流提取超过1 h后，不同提取时间所得甘露醇含量无显著性差异，因此选择热回流提取1 h进行处理。

表4 提取时间对甘露醇提取量的影响(n=3)Table 4 Effects of extraction time on contents of mannitol(n=3)

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线的绘制

精密吸取甘露醇标准品储备液适量，用超纯水稀释成一系列浓度，测定对应浓度下甘露醇的峰面积，以甘露醇浓度(X，mg/mL)对色谱峰面积(Y)绘制标准曲线，得回归方程，y=103860x+2183.9，r=0.9999，线性范围为 0.04 ～9.9 mg/mL。

2.3.2 精密度

取一份样品连续进样5次，计算精密度。结果表明，甘露醇含量的 R.S.D.值为0.54%，精密度良好。

2.3.3 重复性

取同一批样品，按优化后的方法平行制备供试液5份进行测定，考察重复性。结果表明，甘露醇含量的 R.S.D.值为3.76%，重复性良好。

2.3.4 稳定性

取一份样品液分别在 0、5、10、15、20 h进样测定，考察样品稳定性。结果表明，各时间点测定所得甘露醇含量的R.S.D.值为2.71%，因此，样品在20 h內都较为稳定。

2.3.5 标样回收率的测定

分别按照样品所含甘露醇量的50%、100%、150%加入甘露醇标准品进行提取，每组试验重复3次，取样测定甘露醇含量并计算标准品回收率。试验结果(见表5)表明，标样回收率在103.11% ～107.42%之间，平均回收率为 104.27%，R.S.D.值为2.19%，说明该方法对甘露醇标准品的检测特异性良好。

表5 标样回收率的测定Table 5 Determination on recoveries of mannitol from samples

50.45 20 71.06 103.05 50.45 20 71.82 106.85 50.45 40 91.82 103.43 50.45 40 91.85 103.50 50.45 40 90.30 99.63 50.45 60 114.76 107.18 50.45 60 113.91 105.77 50.45 60 113.31 104.77

2.4 不同方法测得蛹虫草子实体甘露醇含量的比较

取同一份子实体材料，分别采用本方法、离子色谱分析法及文献常用的化学比色法对其甘露醇含量进行测定，结果见表6。经比较发现，化学比色法测得的甘露醇含量达8.97%，高效液相色谱法和离子色谱分析法所测结果相近，没有显著性差异。

表6 不同方法测得蛹虫草子实体甘露醇含量的比较(n=3)Table 6 Comparison of mannitol contents in fruiting bodies of Cordyceps militaris determined by different methods(n=3)

3 讨论

本研究选用Shodex公司SUGAR SP0810柱对蛹虫草子实体中甘露醇进行定量分析，对样品前处理方法进行了优化，为避免提取物中含有大量蛋白，对分析柱造成损伤，在保证提取效果的前提下选用90%乙醇做为提取溶剂减少蛋白质的影响。与氨基柱相比，本研究所用流动相仅为超纯水，且分析柱寿命长，对甘露醇分离效果好，是一种分析甘露醇的较好的方法。

三种不同方法测定蛹虫草子实体中甘露醇含量的结果表明，化学比色法所测含量明显偏高，可能有杂质干扰，因此化学比色法仅适用于测定具有一定纯度的甘露醇制品，不太适用于蛹虫草子实体中甘露醇含量的测定。而高效液相色谱法和离子色谱法都能对蛹虫草中甘露醇的含量进行较为准确的分析，相比较而言，离子色谱仪普及度不高，试剂成本较高，所以高效液相色谱法更适于在多数实验室进行。本方法的建立为虫草产品的质量控制提供了较好的依据。

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