藏药翼首草薄层鉴别方法研究

张小梅，杨荣平，励 娜，王云红，梁旭明

重庆市中药研究院，重庆 400065

翼首草为川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck 的干燥全草［1］。性寒，味苦，有小毒。具有解毒除瘟，清热止痢，祛风通痹之功效，为藏医常用药材。翼首草中的主要成分为齐墩果烷型五环三萜皂苷类化合物，此外还含有生物碱、多糖等化学成分。研究表明翼首草正丁醇部位总皂苷具有显著的抗炎活性，且其抗炎的作用与消炎痛效果相似［2］。本文采用翼首草正丁醇部位皂苷成分中游离苷元熊果酸为对照品，对影响翼首草中熊果酸薄层色谱鉴别的因素进行系统研究，为其质量控制提供一定的参考依据。

1 材料

熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110742-200516)，齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110709-200505);高效硅胶G薄层板(青岛海洋化工分厂);其他所用试剂均为分析纯(重庆川东(集团)有限公司化学试剂厂)。

翼首草药材共计13批，产自西藏、青海、四川等，其中有10批为全草，另外3批为根。经重庆市中药研究院院长钟国跃研究员鉴定为Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck。样品来源、产地见表1。

2 方法与结果

薄层色谱鉴别试验条件选择中所用药材均为上述药材来源中的第2批药材。经初步鉴别实验和高效液相色谱含量考察，第2批药材中游离的齐墩果酸和熊果酸的含量在收集到的13批药材中适中，因此考察条件时所用药材均为第2批，且第2批药材量较大。

2.1 薄层鉴别方法的考察

2.1.1 对照品的选择

取翼首草粉(过二号筛)1 g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1.3mg的对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述3种溶液各2～10 μL，点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(接触点样)，以三氯甲烷-丙酮(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。同时置紫外光灯(365 nm)下检视，结果，熊果酸与齐墩果酸在薄层色谱上很难分开，并且经多种展开剂的选择，两斑点依然重叠。经实验的初步考察发现，入药部位为根的3批药材中，齐墩果酸的含量较熊果酸的含量稍高，而入药部位为全草的另外10批药材均是熊果酸的含量远远高于齐墩果酸的含量，因此选择熊果酸为对照品来鉴别翼首草药材。

表1 翼首草药材来源、产地一览表Table 1 Source，origin list of Yishoucao

图1 环己烷-丙酮-乙酸乙酯(6∶2∶1)(13℃/66%)Fig.1 Cyclohexane-Acetone-Ethyl acetate(6∶2∶1)(13 ℃ /66%)

图4 三氯甲烷-丙酮(12∶1)(10℃/60%)Fig.4 Chloroform-Acetone(12∶1)(10 ℃ /60%)

2.1.2 展开系统的考察

按2.1.1项下拟定的薄层鉴别法进行试验，分别以环己烷-丙酮-乙酸乙酯(6∶2∶1)［3］、环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(20∶5∶4∶2)、三氯甲烷-丙酮(4∶1)［4］、三氯甲烷-丙酮(12∶1)为展开剂，结果见图1～4。以展开系统三氯甲烷∶丙酮(12∶1)展开距离适当，供试品中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，斑点清晰且干扰小。

2.1.3 样品处理方法的考察

2.1.3.1 提取溶媒的考察

取翼首草粉(过二号筛)1 g(5份)，精密称定，置锥形瓶中，分别加无水乙醇、95%乙醇、乙醚、三氯甲烷、甲醇各20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为不同溶剂提取供试品溶液。由图1-4可知，乙醚和三氯甲烷提取的样品杂质较95%乙醇、甲醇和无水乙醇少，显色后在与对照品熊果酸相应的位置上斑点较清晰且干扰小。因此选择乙醚作为提取溶剂。

2.1.3.2 溶媒用量的考察

取翼首草粉(过二号筛)1 g(3份)，精密称定，置锥形瓶中，分别加10、20、30 mL乙醚，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。按2.1.1项下拟定的薄层鉴别法进行试验，结果，乙醚用量为30 mL时，供试品中提取的熊果酸相对较多，显色后日光和荧光较清晰并能有效鉴别翼首草药材，因此未考察更多溶剂用量。因此正文中选择供试品溶剂用量为30 mL。

2.1.3.3 超声时间的考察

取翼首草粉(过二号筛)1 g(4份)，精密称定，置锥形瓶中，分别加30 mL乙醚，超声处理10、20、30、40 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。按2.1.1项下拟定的薄层鉴别法进行试验，结果，超声10和20 min时显色后日光和荧光斑点较30和40 min不清晰。而超声30和40 min熊果酸显色后的斑点差不多，较清晰。因此正文中选择供试品超声时间为30 min。

2.1.4 点样量的考察

2.1.4.1 点样量 1

分别取13批翼首草粉(过二号筛)各1 g，精密称定，置锥形瓶中，分别加30 mL乙醚，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。吸取各供试品溶液各4 uL，按2.1.1项下拟定的薄层鉴别法进行试验，结果，第4、6、8批点样4 uL浓度太低，与熊果酸相对应的点显色后不太清晰、而其它多批如第 5、7、9、10、11、12、13 批点样4 uL浓度太高，与熊果酸相对应的点显色后有拖尾的现象，因此应选择不同批样品点样不同。

2.1.4.2 点样量 2

按2.1.1项下拟定的薄层鉴别法进行试验，吸取除第4、6、8批样品溶液8 uL，吸取其它溶液各2 uL点样。结果，除第4、6、8批供试品溶液点样8 uL，吸取其它溶液各2 uL点样合适。

2.1.5 展开环境的考察

2.1.5.1 饱和缸和板的考察

按2.1.1项下拟定的薄层鉴别法进行试验，其中一个预饱和层析缸和板共20 min;另一个饱和缸20 min后分别展开。结果，饱和缸和板的薄层板边缘效要小，对照品和样品显色后斑点清晰且整齐;而只饱和缸的对照品和样品显色后斑点清晰，但样品和对照品相对应的点边缘效应大。因此翼首草薄层鉴别应饱和缸和板。

2.1.5.2 饱和时间的考察

分别饱和缸和板 5、10、20 min 后，按 2.1.1 项下拟定的薄层鉴别法进行试验。结果，饱和缸和板5 min时显色后样品和对照品斑点清晰但边缘效应较饱和缸和板10、20 min差，而饱和缸和板10、20 min时斑点清晰且边缘效应较小，因此选择饱和缸和板10 min。

2.1.5.3 温度的考察

分别在温度为10、20、30、40 ℃条件下，按2.1.1 项下拟定的薄层鉴别法进行试验。结果，不同温度对翼首草药材的薄层鉴别没有影响。

2.1.5.4 湿度的考察

分别在湿度为40%、60%、80%条件下，按2.1.1项下拟定的薄层鉴别法进行试验。结果，不同湿度对翼首草薄层鉴别没有影响。

2.1.6 翼首草的薄层鉴别

取本品粉末1 g(13批)，精密称定，置锥形瓶中，加乙醚30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2～8 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮(12∶1)为展开剂，饱和缸和板10 min，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。同时置紫外光灯(365 nm)下检视，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。13批样品均能鉴别出熊果酸。结果见图5。(沙棘)，2003，16(4):33-34.

图5 翼首草样品薄层鉴别(11℃/80%)Fig.5 Thin-layer chromatography of Yishoucao(11℃/80%)

3 讨论

3.1 藏药翼首草为2010版药典新上药材品种，本实验首次对翼首草中熊果酸的薄层鉴别进行系统研究，经全国4个主产区、13批药材进行了多次重复试验，表明本法斑点清晰，易于检出，分离效果较好、重现性好，能有效控制翼首草药材的质量。

3.2 从翼首草液相含量测定结果知，3批根中熊果酸含量明显低于齐墩果酸，本文从薄层图上也可以验证看出3批根在与熊果酸对照品相应的位置上斑点相对其它批次较小，颜色相对较淡，从一定程度上这也能有效区别根与带根全草之间的质量差别，为临床提供一定参考依据。

3.3 由于山茱萸、山楂、栀子、木瓜等中药中均含有熊果酸，也可以熊果酸为对照品鉴别相应药材，对其进行质量控制，因此有必要分离专属成分来鉴别翼首草药材，对翼首草药材中的成分有待进一步研究。

1 State Administration of traditional Chinese materia medica editorial board.Chinese herbal medicine，Tibetan Medicine Vol.(中华本草·藏药卷).Shanghai:People’s Medical Publishing House，2002:366-368.

2 The people＇s Republic of China Pharmacopoeia Committee of Ministry of health.The people＇s Republic of China Ministry of Health(Tibetan Medicine)Book 1(中华人民共和国卫生部药品标准(藏药)第一册).1995，138.

3 Chinese Pharmacopeia(ChP，1).2005:31.

4 Dong HL(董海丽)，Zong W(纵伟).Determination of oleanolic acid in Chinese quince by thin layer seperationspectrophotometry method.Anhui Agric Sci Bull(安徽农学通报)，2007，13(15):26.