用最小距离逐步取样法构建野核桃核心种质

袁海涛，董玉芝，王肇延

(新疆农业大学 林学与园艺学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

种质资源是品种选育的重要物质基础，因此其搜集和保护越来越受到各国研究学者所重视。随着世界各国种质资源库数量的不断增加，种质资源规模过大而难以管理和利用这一难题便出现于研究者面前。为了解决这一难题，Frankel［1］于1984年首次提出了核心种质 (core collection)的概念，之后，Frankel与 Brown［2－3］又进一步地发展了核心种质这一概念，核心种质即采用一定的方法，从整个种质资源中选择一部分样本，以最小的资源数量和遗传重复最大程度地代表整个种质资源的多样性，从而方便于种质的保存、评价和利用，但核心种质以外的资源材料并不被遗弃，而作为保留种质保存。

新疆野核桃 (Juglans regia)在我国仅分布于新疆伊犁哈萨克自治州巩留县野核桃沟自然保护区，主要保护对象是第3纪温带落叶阔叶林的残遗植物——野核桃及其生境。这片野核桃林是世界稀有、亚洲唯一的野核桃林，经考证，该林中生长的野核桃是栽培核桃的直接祖先［4－5］。野核桃林中蕴含了野核桃大量优良性状的基因，拥有十分丰富的种质资源，储备着我国重要的核桃资源，是研究栽培核桃起源、进化、自然选择不可多得的原始材料。

从野生核桃的研究文献中发现，在2006年以前，学者们对新疆野生核桃林的研究基本局限于生存环境、形态分类、生物学等方面［6－11］，2007年刘晓丽［12］首次利用分子系统学的原理采用SSR分子标记技术对新疆伊犁野核桃、喀什实生核桃及部分栽培品种的遗传结构进行了分析，结果表明伊犁野生核桃的遗传多样性最低。2010年王肇延采用SSR分子标记技术对新疆伊犁巩留县野核桃进行了遗传多样性分析［13］。但野核桃核心种质构建方面系统深入的研究却未见报道。本文利用新疆伊犁巩留县野核桃SSR分子标记数据，运用最小距离逐步取样法构建野核桃核心种质，以求为野核桃今后的保护、育种和利用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

采集新疆野核桃沟的野核桃叶片4 457份，占野核桃沟内野核桃总数的95.93% (地径大于10 cm的)。

1.2 分子标记

采用SSR分子标记方法，用筛选出的13对引物对4 457份试材进行标记。

将SSR标记扩增产物的电泳结果数值化，在相同的迁移率位置上，杂合带记为1、上带记为2、下带记为3、对于谱带模糊不清或由其他原因造成的数据缺失记为9。将数值统计结果录入计算机，建立多元数据矩阵。本文作者和王肇延［13］共同完成了采样、提取DNA、引物筛选、SSR分子标记实验和数据的整理，实验数据真实可靠。

1.3 核心种质构建方法

根据SSR标记得到的数据，利用SPSS18.0软件用欧氏距离 (euclidean distance)来衡量，采用Ward's法进行聚类分析。

1.3.1 总体取样比例

根据国内外关于核心种质的研究结果，核心种质的规模一般占原始群体的30%～5%，考虑到新疆野核桃群体内遗传变异小的特点，故选取占原始群体样品30%～1%比例范围的样品作为核心样本集。

1.3.2 取样方法

根据聚类结果用最小距离逐步取样法 (least distance stepwise sampling strategy， LDSS)［14－15］:找出遗传距离最小的一个组，随机删除该组2样品之一，另一个样品被保留。若组中包含2份以上的样品，则只随机保留一个进入下一轮聚类，其余样品去除。

1.4 核数据分析

根据相关遗传参数的公式，在Excel 2007中计算出各个核心样本集的Nei's遗传多样性指数和Shannon信息指数，并用SPSS18.0对得到的 Nei's遗传多样性指数 (Nei's gene diversity，H)和Shannon信息指数 (Shannon's Information index，I)进行t检验分析。

本文采用平均Nei's基因多样性指数和平均Shannon信息指数进行数据分析。

其中，Ρi为种群中第i个等位基因的频率，n为等位基因数目。

2 结果和分析

2.1 核心种质的选择

根据各个核心样本集遗传多样性保留率的比较，同时在最大限度保留原始种质遗传变异的原则上，选取431份样本作为核心种质，其平均Shannon信息指数保留率和平均 Nei's基因多样性指数保留率均达100%。

2.2 核心种质与初始种质的比较

从表1中可以看出核心种质的Shannon信息指数保留率和Nei's基因多样性指数保留率均达到百分之百，说明核心种质群体在基本保持其初始群体遗传结构的同时，其遗传差异性较初始种质群体要大，遗传多样性较初始种质群体丰富。

从表2可以看出核心种质Nei's基因多样性指数和Shannon信息指数在概率0.05水平上不显著，表明核心种质能较好地代表初始种质。

表1 核心种质与初始种质多样性指数的比较

表2 核心种质与初始种质t检验结果

2.3 保留种质与核心种质的比较

从表3可以看出，比较Nei's基因多样性指数和Shannon信息指数，核心种质均大于保留种质。从表4中可以看出，核心种质的Nei's基因多样性指数和Shannon信息指数在在95%置信区间上与保留种质差异不显著。但核心种质的Nei's基因多样性指数和Shannon信息指数均大于保留种质，可以优先选用。

表3 保留种质与核心种质遗传多样性的比较

2.4 微型核心种质

种质资源量过大，会给资源的保存、评价、鉴定和利用带来诸多困难，鉴于此，有的学者提出了微型核心种质 (mini core collection)的概念，即将核心种质的规模进一步压缩，仅用1%的样本数代表整个种质资源群体的遗传多样性［15］。

本研究所选取的核心种质样本量为431份，样本量略大，在实际的保护和利用方面可能会存在问题。基于此，本研究另选取所构建的核心子集中49份样本作为微型核心种质，其Nei's基因多样性指数和Shannon信息指数的保留率分别达到了98.32%和98.77%，说明微型核心种质可以代表初始种质的遗传多样性。

表4 保留种质与核心种质的Nei's基因多样性指数和Shannon信息指数t检验结果

3 小结和讨论

2008年巩留县野核桃自然保护区被批准为4A级旅游景区后，越来越多的游人到野核桃沟参观游览，这同时对保护珍贵的物种形成了严重威胁。因此，构建野核桃核心种质对野核桃种质资源进行有效地保护和利用意义重大。

通常情况下，核心种质的总体取样比例30%～10%，但对于无性繁殖的野核桃来说，其生存环境相对封闭，遗传变异均发生在种内，极少的样本可能就会代表整个群体的遗传多样性。本研究所构建的核心种质仅占野核桃总体的9.67%也说明了这一点。

新疆伊犁巩留县野核桃内的野核桃是一个相对封闭的聚居群，野核桃群体数量巨大，形态性状等基础数据采集十分困难，特别是果实性状数据无法采集全面 (因为野核桃沟内许多野核桃树不结果，课题组以每株至少20粒野核桃果实的数量进行采集，经过2年2批次的采集仅采集到418株的野核桃果实)。因此分子标记数据的获取就显得相对易行。另外，分子标记数据并不像形态性状等基础数据那样易受环境影响，分子数据更具有稳定性的优点。

在构建野核桃核心种质过程中，受到样本巨大、时间紧迫等客观因素制约，所以仅采用了一种分子标记实验 (仅有13对SSR分子标记引物)和一种构建核心种质的方法。这有待于后来的研究者在采用其他分子标记、增加引物和运用不同构建方法等方面来完善。另外，在野核桃基础数据逐步完善的情况下，采用基础数据和分子数据相结合的方法，也是切实可行的。

［1］Frankel O H．Genetic perspectives of germplasm conservation［G］//Arber W，Limensee K，Peacock W J，et al．Genetic Manipulation:Impact on Man and Society．Cambridge，UK:Cambridge University Press，1984，161 －170．

［2］Frankel O H，Brown A H D．Plant genetic resources today:A critical appraisal［G］//Holdon J H W．Crop Genetic Resources:Conservation and Evaluation．London:George Allen and Unwin Press，1984:249－257．

［3］Brown A H D．The case for core collection［G］//Brown A H D，Frankel O H，Marshallr D，et al．The Use of Plant Genetic Resources．Cambridge:Ambridge University Press，1989:136－156．

［4］林培钧，崔乃然．天山野果林资源 ［M］．北京:中国林业出版社，2000:178－189．

［5］曾斌．新疆野生核桃资源的现状与发展 ［J］．北方果树，2005，7(4):1－3．

［6］张钊．新疆野核桃的调查研究 ［M］．乌鲁木齐:新疆农业出版社，1962，(10):404－407．

［7］张新时．伊犁野果林的生态地理特征和群落学问题 ［J］．植物学报，1973，15(2):239－253．

［8］新疆维吾尔自治区自然保护区考察队 ［J］．新疆的野核桃林:林业科技通讯，1982(10):15－18．

［9］王磊，崔乃然，张汉斐．新疆野核桃研究 ［J］．干旱区研究，1997，14(1):18－26．

［10］王磊，李霞，杨辽，等．新疆野核桃种质资源数量分类研究 ［J］．北方园艺，1998(1):1－5．

［11］王磊．新疆野核桃、野樱桃李和野扁桃 ［J］．新疆农业科学，1990(1):33－34．

［12］刘晓丽．核挑SSR反应体系的优化及群体遗传多样性分析［D］．济南:山东农业大学，2007．

［13］王肇延．新疆野核桃资源调查及遗传多样性分析 ［D］．乌鲁木齐:新疆农业大学，2011．

［14］Wang J C，Hu J，Xu H M，et al．A strategy on constructing core collection by leastdistance stepwise sampling ［J］．Theoretical and Applied Genetics，2007，115(1):1 －8．

［15］Upadhyaya H D，Ortiz R．A mini core subset for capturing diversity and promoting utilization of chickpea genetic resources in crop improvement［J］．Theoretical and Applied Genetics，2001，102:1292－1298．