两株脂肪类混合细菌拆分缩水甘油丁酸酯的工艺研究

黄 强，孟庆意，牛柏林，张 蕊，高莹玉

(郑州大学化工与能源学院，河南郑州450001)

0 引言

缩水甘油丁酸酯是重要的手性药物中间体，在药物、液晶、农药和生物探针等领域中应用［1］.国内的研究者对其进行了相关的研究［2-3］和报道［4-5］，但鲜有两株脂肪类细菌拆分缩水甘油丁酸酯的研究报道.据市场估计，手性化合物将会带来巨大的市场价值［6］，欧美等国把手性化合物研究作为战略研究的一部分.手性药物的拆分和合成的方法主要有［8］：酶法合成、萃取、膜法以及生物催化制备等.笔者通过最适产酶条件下工艺研究，得到(R)-缩水甘油丁酸酯的对映体过量值(ee)达到92%，转化率为83.2%.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

土样来源：郑州大学校园内和周边餐馆土壤.缩水甘油丁酸酯是由环氧氯丙烷和正丁酸钠合成，并对照红外光谱图与标准图谱，两者一致，经气相色谱仪(GC98OO，中国上海科创色谱仪器有限公司)测定，含量在99%以上，为无色黏性液体;旋光仪(上海物理光学仪器厂，WZZ-2S型);配制培养基所用的试剂为化学纯，其它的试剂为分析纯.

1.2 实验方法

1.2.1 实验中使用的培养基

土壤富集培养基：(NH4)2SO42.0 g，NH4NO32.0 g，MgSO4·7H2O 0.16 g，KH2PO40.32 g，NaCl 0.5 g，大豆油 5.0 mL，蒸馏水 250 mL，pH=9.0.

平板分离培养基：大豆油10 mL，(NH4)2SO42.0 g，NH4NO32.0 g，MgSO4·7H2O 0.16 g，KH2PO40.32 g，琼脂 4.0 g，CaCO31 g，NaCl 0.5 g，蒸馏水 250 mL，pH=7.0.

细菌种子液培养基：大豆油 5mL，(NH4)2SO42.0 g，NH4NO32.0 g，MgSO4·7H2O 0.16 g，KH2PO40.32 g ，NaCl 0.5 g，蒸馏水 250 mL，pH=9.0.

种子液拆分培养基：淀粉1.5 g，牛肉膏3 g，KH2PO41 g，NaCl 0.5 g，蒸馏水400 mL，pH 自然.

1.2.2 细菌富集的方法

称5 g土样加入有20 mL灭菌水(蒸汽灭菌器灭菌)的试管中，摇动后取5 mL悬浮液加入盛有30 mL富集培养基的三角烧瓶中，35℃，摇瓶120 r/min振荡3 d后，取5 mL培养液至另一个盛有新培养基的三角烧瓶中继续振荡培养3 d.富集3次，然后进行平板分离.

1.2.3 平板分离的方法

先将平板分离培养基灭菌后冷却至60℃，倒入平板内，再将经富集培养的细菌液用无菌水进行适当稀释(本实验采用10-4和10-5两个稀释度)，并取0.5 mL涂布于分离平板上，在35℃下，细菌培养3 d，由于平板培养基中有CaCO3，微生物产生的脂肪酶与大豆油作用后会生成脂肪酸与CaCO3发生作用，产生透明圈，生成的脂肪酸越多透明圈就越大，然后将透明圈较大的细菌菌落挑至斜面培养基上保存.

1.2.4 细菌培养的方法

细菌种子培养：从斜面菌种接种一环至装液30 mL的250 mL三角瓶中，在30℃，转速200 r/min下进行摇床振荡培养.

细菌菌液培养：待种子培养24 h后，取1 mL的接种量接种于装液有60 mL的500 mL的三角瓶中，在30℃，转速200 r/min下进行48 h的摇床振荡培养.

1.2.5 脂肪菌催化拆分缩水甘油丁酸酯的方法

取30 mL的菌液，加入标准的苯二甲酸氢钾缓冲液调节pH，再加入0.5 g的底物，调节好温度，200 r/min振荡反应，可得到拆分产物与细菌液的混合液.

1.2.6 细菌酶活的测定

测定方法：取250 mL三角瓶，加入5 mL缓冲液和6 mL底物乳化液，在35℃恒温水浴中预热10 min，加入1 mL待测样品液，迅速摇匀并保温计时，反应30 min后立即加入体积分数为95%的乙醇10 mL终止酶作用，加入2滴1%酚酞指示剂，用经过标定的0.02 mol/L的NaOH溶液滴定至微红色，并记录耗碱量.对照样品先经过乙醇的灭活酶后同样处理.

脂肪酶活力［9］定义：在30℃，pH=7.0下催化水解橄榄油，每分钟产生1 μmol的脂肪酸的酶量定义为1个单位(U).本实验所测定的脂肪类细菌的酶活为1.5 U.

1.2.7 缩水甘油丁酸酯含量的测定

利用气相色谱仪(GC98OO，中国上海科创色谱仪器有限公司，SE-30为填充柱填料，填充柱：3 mm×1.5 m.热导检测仪和进样温度为：230℃，柱温：130℃;氢气流量：40 mL/min.柱前后压：0.05 mPa.)测定缩水甘油丁酸酯的含量.

1.2.8 (R)-缩水甘油丁酸酯的光学纯度的测定

将30 mL的三氯甲烷加入到混合液中，萃取并离心破乳，用分液漏斗分离.用旋光仪(上海物理光学仪器厂，WZZ-2S型)测定液体的旋光度∝，求出比旋光值［α］(［α］=L=1.5 dm)对映体过量值 ee=100%(［α］最大为31°).

2 实验结果与讨论

2.1 筛选拆分缩水甘油丁酸酯的细菌

采集校园和餐馆周边经常接触油脂类的土样15个，经土样富集培养和平板分离，可以得到变色圈大小不同的群落，结果如表1所示.

表1 细菌培养基菌落特点Tab.1 feature of bacteria colony culture

表1中10-4，10-5分别表示细菌的两个稀释度.“+”表示培养基中存在透明圈不大的菌落，且菌落不是很多;“++”表示有较明显的透明圈，菌落个数一般;“+++”表示培养基有较多的菌落，且有较大的透明圈;“-”表示培养基中没有出现透明圈的菌落，或者几乎很少.

由表1 可知 1，3，4，7，8，10，11，12，13，15 号土样在细菌培养基中长出了透明圈的菌落，从中说明这些菌能分解酯产生脂肪酸，从中挑选产酶能力较强的菌，保存至斜面.

2.2 细菌脂肪酶活力的测定

将有“+”，“++”和“+++”的单菌株重新进行培养，测定其酶活.结果如表2所示.

从中选择 1(2)，3(3)，3(4)，3(5)，3(8)，7(5)，10(2)，13(3)，15(1)，8(2)等 10 种菌株进行下一步的培养和细菌筛选.利用缩水甘油丁酸酯培养测量酶活，从中选择3(3)和13(3)两株进行混合培养.

2.3 优化考察拆分缩水甘油丁酸酯产生菌的条件

分别考察碳源、氮源、pH、温度、振荡速率、装液量等因素条件，培养3 d，如图1～6和表3所示.从图1～图6分析得出，淀粉为碳源，牛肉膏为氮源，初始pH=8.0，温度30℃，转速200 r/min，摇瓶2 d，装液量50 mL，产酶量最佳.

表2 细菌酶活测定结果Tab.2 Result of enzymatic activity

2.4 混合菌拆分缩水甘油丁酸酯工艺条件的研究

2.4.1 反应过程中最佳pH工艺的选择

据筛选实验方法，反应温度定为30℃，摇床振荡速率为200 r/min，底物量为0.5 g，不同pH(5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)条件下细菌催化拆分缩水甘油丁酸酯，反应12 h后，测定缩水甘油丁酸酯的转化率及(R)-缩水甘油丁酸酯的ee值，其结果如图7所示.当pH=6.0时，双菌的立体拆分最佳，产物ee值达到了89.8%，缩水甘油丁酸酯的转化率为84.6%;在pH范围内，转化率在65.1% ～84.6%，ee值在23.8% ～89.8%.

表3 培养细菌各个因素条件Tab.3 Every effected factor of bacteria medium

图7 pH值对于对映体过量值(ee)的影响Fig.7 Effect of pH on ee

2.4.2 反应过程中最佳温度工艺的选择

在pH=6.0，转速200 r/min下，在底物加入量为0.5 g，拆分12 h下，试验在不同温度下(26，28，30，33，35℃)的缩水甘油丁酸酯转化率和ee值，其结果如图8所示.当反应温度在28℃时，两株细菌有较好的拆分效果，ee值达到82.3%.试验温度范围内，转化率在78.2% ～83.9%之间，ee值在51.7% ～82.3%.

图8 温度对于对映体过量值(ee)的影响Fig.8 Effect of temperature on ee

2.4.3 反应过程中最佳底物量工艺的选择

在28℃，拆分12 h，200 r/min下，试验在30 mL细菌液中加入不同底物量(0.3，0.5，0.8，1.0，1.2，1.4 g)对拆分反应的影响，其结果如图9所示.当底物量为0.5时，ee值为82.3%;底物0.3 g时，转化率为98.8%，ee值为75.4%，随着底物量的增加，缩水甘油丁酸酯的转化率降低，范围为 60% ～83.7%，ee值范围为 25.1% ～82.3%.

图9 底物量对于对映体过量值(ee)的影响Fig.9 Effect of substrate amounts on ee

2.4.4 最佳反应时间工艺的选择

在28℃ ，底物量0.5 g，pH=6.0，转速200 r/min 下，试验不同的反应时间(5，7，12，15，20 h)对拆分反应的影响，如图10所示.当反应5 h时，缩水甘油丁酸酯转化率为65.7%，ee值为25.3%;随着反应时间的延长，ee值逐渐提高，在12 h时产物ee值最高达到92.8%，转化率为83.2%，在反应20 h时，ee值为74.3%.

图10 反应时间对于对映体过量值(ee)的影响Fig.10 Effect of reaction time on ee

2.4.5 最佳反应振荡速率工艺的选择

在28℃，pH=6.0，拆分12 h，底物量0.5 g下，试验不同的振荡速率(160，180，200，210，220 r/min)对拆分反应的影响，其结果如图11所示.两株细菌拆分缩水甘油丁酸酯反应的转化率和立体选择性与反应振荡速率的相关性很小，缩水甘油丁酸酯转化率在83.1% ～85.5%，ee值在80.6% ～92%，以200 r/min为最佳.

图11 振荡速率对于对映体过量值(ee)的影响Fig.11 Effect of rotating rate on ee

2.4.6 最佳反应条件的试验

在28 ℃，pH=6.0，转速200 r/min，拆分12 h下，底物量0.5 g，测定了缩水甘油丁酸酯的转化率和ee值，其结果为ee值达到92.8%，转化率达到83.2%.

3 结论

由于从土壤筛选出的十几个单株细菌拆分效果不理想，从中优选出两株脂肪类细菌混合使用，拆分效果良好，经文献［10］方法鉴定为：短杆菌属和霉菌，筛选工艺为：淀粉为碳源，牛肉膏为氮源，初始pH=8.0，温度30℃，转速200 r/min，摇瓶2 d，装液量50 mL，产酶量最佳，为1.5 U，未进行诱变.工艺条件为：28℃，pH=6.0，30 mL脂肪类双菌液中加入0.5 g缩水甘油丁酸酯，在振荡12 h，转速200 r/min下，拆分效果良好，(R)-缩水甘油丁酸酯的对映体过量值(ee)为92.8%，转化率为83.2%，拆分效果良好，操作工艺简单，可以用于研究和后续的开发应用.

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