虾过敏C57/BL6小鼠动物模型的建立

黄建芳，王彩霞，向军俭，郭 洁，吕 思

(广东省分子免疫与抗体工程重点实验室，暨南大学抗体工程研究中心，广东广州510632)

近年来，随着工业化程度的提高和转基因农产品的商业化，过敏性疾病发病率呈不断增长趋势，食品过敏已成为全球关注的公共卫生问题之一［1］。为此，国际食品法典委员会和一些发达国家及地区纷纷制定了食品过敏原标识法规，其中美国和欧盟已经进入强制性实施阶段［2-3］。因此，对食品过敏原的检测与安全性评价已成为食品安全研究领域一个重要的课题。诊断、检测食品过敏原的方法分为体内实验和体外实验，体内实验如皮肤实验虽然可提供食物过敏最为直接的证据，但出于安全和伦理方面考虑，不适合大规模开展;体外实验主要是检测血清中特异lgE含量，此方法依赖大量过敏患者血清，并且血清IgE也不完全与过敏反应相关，无法真实反映机体的过敏状态［4-5］。以动物模型和细胞模型为主的特异性体外定性、定量检测技术兼备了体内实验和体外检测的优点，其特异、安全、灵敏，将成为食品过敏原检验、检测和评价的关键技术。目前国内对食物过敏动物模型和细胞模型及其评价体系的研究比较缺乏［6］。本实验拟建立C57/BL6小鼠虾过敏动物模型及肥大细胞组胺体外释放模型，Western Blot分析致敏小鼠血清特异性lgE和lgG1抗体，并用虾不同过敏原组分体外诱导致敏小鼠腹腔肥大细胞脱颗粒，分析组胺释放率的差异，从而为建立体外过敏原检测与评价的动物模型和细胞模型奠定基础，为我国食品过敏原的标准化及解决食品中过敏原标识等问题提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

C57/BL6小鼠 6周龄，9只，南方医科大学实验动物中心;HRP-山羊抗小鼠 IgE抗体 美国Bethyl公司;HRP-山羊抗小鼠 IgG1抗体 美国SouthernBiotech公司;淋巴细胞分离液 天津TBD公司;虾过敏原蛋白 分子量21、36、80ku，由本实验室鉴定并纯化;重组尘螨蛋白Der f1 由深圳大学生命科学学院刘志刚教授惠赠;组胺标准品、牛血清白蛋白(BSA)、邻苯二甲醛(OPT)Sigma公司;DAB底物试剂盒 Tiange生物技术(北京)公司。

Safire荧光酶标仪 瑞士Tecan公司;HPLC仪器为Agilent 1100 series 美国安捷伦公司。

1.2 C57/BL6小鼠致敏

C57/BL6小鼠随机分成两组，虾粗提液致敏组和PBS对照组，饲养一周后开始免疫，0.5mg/mL虾蛋白粗提液与2.5mg/mL Al(OH)3佐剂等体积混匀后，皮下多点注射，0.2mL/只，对照组注射等体积0.01mol/L pH7.4 PBS与Al(OH)3佐剂混合液，每隔一周激发免疫1次，观察激发后过敏症状。激发第三次后一周加强免疫。

1.3 Western Blot分析小鼠血清中的特异性lgE和lgG1抗体

虾蛋白粗提液先经SDS-PAGE分离，再转移至PVDF膜上，转印后将膜分泳道切成细条。5%脱脂奶粉37℃封闭1h;稀释的虾致敏小鼠血清37℃孵育2h，PBS对照组小鼠血清设阴性对照;PBST洗涤，加入HRP标记羊抗小鼠 IgE(1∶10000)或 IgG1二抗(1∶2000)37℃孵育 2h;PBST与 PBS洗涤后，HRPDAB底物显色;蒸馏水终止反应。

1.4 小鼠PMC分离纯化

小鼠加强免疫后一天，摘眼球采血处死，分离血清，-20℃储存备用。向小鼠腹腔注射5mL HBSS液，按摩小鼠腹部5min，抽取腹腔液，将其缓慢注入装有淋巴细胞分离液的离心管中，4℃ 1500r/min离心10min，吸出中间层的细胞，即为肥大细胞。用HBSS液洗两次，冲洗后的细胞重新悬浮于3mL HBSS液中，置于4℃备用。

1.5 小鼠PMC的计数及鉴定

悬浮的PMC分别用台盼蓝和甲苯胺蓝染色，显微镜下观察活细胞和肥大细胞纯度比例，调整各组细胞浓度使其一致。

1.6 诱导小鼠PMC释放组胺

详细方法参考肥大细胞的激发实验［7］，略作改进。激发管中分别加入100μL 100μg/mL虾蛋白粗提液、相对分子量为36ku的虾原肌球蛋白、相对分子量为21ku或80ku的虾过敏原组分作为实验组;100μL 100μg/mL的蟹蛋白粗提液、尘螨蛋白Der f1和BSA等作为阴性对照;激发管中直接加入100μL HBSS液作为空白对照组(自发组胺释放组)和总组胺释放组。然后，将分离好的PMC 37℃水浴箱中预培养5min后，向各个激发管中加入100μL的细胞悬液;实验组、阴性对照组及空白对照组激发管置于37℃水浴箱中反应 20min，然后加入 150μL冷的HBSS液终止反应，4℃ 2000r/min离心10min后取上清，置4℃备用;总组胺释放组的激发管用沸水煮沸2min，冰浴5min后离心后取其上清。相同实验方案重复5次，每个样品测定2次取其均值。

1.7 组胺释放率的测定

1.7.1 荧光酶标仪测组胺定向释放率 100μL的样品(即实验所得上清)加到含150μL三蒸水的96孔荧光酶标板中，依次加入50μL 0.4mol/L NaOH和10μL OPT，避光反应 10min，加入 50μL 0.1mol/L HCl终止反应，然后用荧光酶标仪于吸收光349nm和发射光448nm测定荧光(IU)值。同时用系列稀释的组胺标准品制定标准曲线，据此，计算各样品组胺的释放量，组胺的释放率依据以下公式获得:

组胺的释放率(%)=［(定向组胺释放量-自发组胺释放量)/总组胺释放量］×100。

1.7.2 HPLC测组胺定向释放率 HPLC测定样品组胺定向释放量，测定的色谱条件为:zorboxSB-C18反相色谱柱，4.6mm×150mm，粒径5μm;流动相为甲醇-pH4.5醋酸钠溶液(45∶55)，流速 1.0mL/min;反应液为0.1%OPT的甲醇溶液;荧光检测器波长:激发波长350nm，发射波长444nm。每份样品平行测定两次，以色谱保留时间作为组胺定性分析依据，样品组胺出峰面积做定量分析，用系列稀释的组胺标准品的制定标准曲线计算组胺释放率。

定向释放率(%)=(定向组胺释放量-空白对照组胺释放量)/总组胺释放量×100。

1.8 统计学分析

全部结果均采用SPSS(13.0版)软件分析。组间数据的比较采用t检验，p＜0.01具有极显著性差异;p＜0.05具有显著差异，p＞0.05无差异。

2 结果与分析

2.1 致敏小鼠过敏症状分析

第二次免疫激发后，致敏C57/BL6小鼠出现明显过敏症状，前爪频繁捎挠口鼻处，体毛直立，身体颤抖，呼吸频率加快，精神萎靡，活动减少;对照组无过敏症状，说明C57/BL6小鼠成功致敏。

2.2 Western Blot分析致敏C57/BL6小鼠血清中的特异性lgE和IgG1抗体

Western blot分析致敏C57/BL6小鼠血清特异性IgE和IgG1抗体，免疫PBS的小鼠血清作阴性对照，结果分别见图1A和1B。结果显示，57.1%(4/7)的致敏小鼠血清IgE和74.1%(5/7)的血清IgG1能特异性识别分子质量为36ku的原肌球蛋白;42.9%(3/7)的小鼠血清IgE和28.6%(2/7)的血清IgG1能识别21ku的过敏原组分;42.9%(3/7)的血清IgE和血清IgG1能识别80ku的过敏原组分。结果表明，36ku的原肌球蛋白是C57/BL6小鼠的主要过敏原，21ku和80ku的过敏原组分是次要过敏原，且它们不仅能引起IgE介导的速发型过敏反应，还可以引起IgG介导的过敏反应。

图1 C57/BL6小鼠血清IgE和IgG1与虾蛋白粗提液的Western blot图Fig.1 Western Blot of sera IgE and IgG1 from C57/Bl6 mice to shrimp extract

2.3 小鼠PMC计数及活性鉴定

台盼蓝和甲苯胺蓝染色后分别镜下计数观察:能被被台盼蓝染成蓝色的为死细胞，其余为活细胞;能被甲苯胺蓝染成紫红色的细胞为肥大细胞。结果显示，总细胞细胞密度为1.2×106个/mL，其中活细胞占总细胞的95%，肥大细胞占活细胞数的90%以上。

2.4 PMC组胺定向释放率的测定

2.4.1 荧光酶标仪法测定组胺定向释放率 荧光酶标仪法测定各组致敏小鼠PMC组胺定向释放率结果(如图2)显示，虾蛋白粗提液、21ku蛋白、36ku蛋白及80ku蛋白等实验组与空白对照组间均有极显著差异(p＜0.01，n＞5)，阴性对照组中的蟹蛋白粗提液组与空白对照相比具有显著差异(p＜0.05，n＞5)，其它阴性对照组与空白组相比均无显著差异。虾过敏组分中，36ku原肌球蛋白诱导的组胺释放率最高，为21.59%，80ku和21ku蛋白次之，分别为11.29%和14.39%，这与文献报道的原肌球蛋白是虾的主要过敏原相一致。与空白对照组相比，蟹蛋白粗提液诱导的组胺释放率也具有显著性差异(p＜0.05)，表明蟹蛋白粗提液中具有与虾过敏原相似或相同过敏原表位的蛋白，这与文献报道的虾、蟹过敏原间存在交叉反应相一致;Der f1蛋白组与BSA组与空白对照组无显著差异，说明尘螨过敏原及牛奶过敏原都与虾过敏原间不存在交叉反应。

2.4.2 HPLC法测定组胺定向释放率 HPLC法测定系列浓度组胺建立的标准曲线见图3A，测得并计算的各组致敏小鼠PMC组胺定向释放率的结果见图3B。结果显示，与空白对照组相比，虾粗提液、21ku蛋白、36ku蛋白及80ku蛋白等实验组均有极显著差异(p＜0.01，n＞5);阴性对照组中的蟹蛋白粗提液组与空白对照相比具有显著差异(p＜0.05，n＞5)，其它阴性对照组与空白组相比均无显著差异。HPLC测定的组胺释放率的结果与荧光酶标仪法测定的结果无显著差异，且定向诱导PMC释放组胺的释放率高低的过敏原是一致的。结果表明荧光酶标仪法和HPLC都可以用于组胺含量的测定。

图2 荧光酶标仪测定PMC组胺定向释放率Fig.2 Detecting of histamine release ration from peritoneal mast cell by Fluorescence microplate reader

图3 HPLC测PMC组胺定向释放率Fig.3 Detecting of histamine release ration from peritoneal mast cell by HPLC

3 讨论

目前，运用动物模型和细胞模型评价、预测食物的致敏性是国际上研究和开发的热点领域［8］。文献报道的过敏动物模型有:C3H/HeJ小鼠、Balb/C小鼠、C57/BL6 小鼠、BN 大鼠、豚鼠及幼猪、狗等［6，8-9］。不同品系的动物对不同食物过敏原的敏感性和特异性存在差异［9］，因此研究实验动物对食物过敏原免疫应答的敏感性和特异性及其与人类过敏的异同，即需选择合适品系的动物建立评价和检验不同过敏食物或过敏原的动物模型。

本研究运用虾蛋白粗提液致敏C57/BL6小鼠，采用过敏相关抗体-血清IgE和IgG1来评价分析C57/BL6小鼠与人类对虾中不同过敏原组分产生过敏反应的异同。结果显示，相对分子量为36ku的虾原肌球蛋白C57/BL6的主要致敏原，相对分子量为21ku和80ku的蛋白是C57/BL6的次要过敏原，这与文献报道［10-11］虾原肌球蛋白是人类的主要虾过敏原，21ku和80ku蛋白为人类虾次要过敏原相一致;此外，蟹蛋白粗提液能定向诱导虾致敏小鼠PMC定向释放组胺，与文献报道［12］的虾、蟹过敏原间具有交叉反应相一致，表明人类与C57/BL6小鼠对虾中不同过敏原组分的敏感性具有高度的相似性。因此，C57/BL6小鼠是评价和检测虾过敏原的良好动物模型，同时也可能是研究人类的虾过敏机制甚至复杂食物过敏机制的有效动物模型。

另外，本文通过运用虾不同过敏原组分体外定向诱导虾致敏小鼠PMC释放组胺释放率的差异，分析虾不同过敏原的致敏差异的结果显示，36ku原肌球蛋白诱导的组胺释放率最高，其次是80ku和21ku蛋白，这与致敏小鼠血清IgE和IgG1等过敏相关抗体的检测结果一致，表明体外检测组胺释放的方法可以作为评判过敏原致敏性的有效方法，为建立更加简便、快速的过敏原检测方法提供了方向。然而，同一物种不同个体对过敏原的致敏性存在差异，不同物种间差异性更大，因此用单一小鼠模型和致敏的小鼠肥大细胞模型来评价食物过敏原具有一定的局限性。因此，我们下一步将探讨各种不同过敏食物的最佳动物模型，同时构建表达人IgE高亲力受体FcεRI的工程细胞株［13-14］或者直接用人的肥大细胞株作为细胞模型分析不同过敏原的致敏性差异，建立研究食物过敏机制和食物过敏原检测的新模型。

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