响应面法优化新疆胀果甘草多糖的提取工艺

刘文玉，颜雪琴，林祥群，魏长庆

(1.新疆石河子职业技术学院，新疆石河子832000;2.石河子大学食品学院，新疆石河子832000)

甘草(Glycyrrhiza spp.)为豆科甘草属多年生草本植物，是新疆荒漠区最主要的植被物种之一，分布面积广、贮量大，其性甘、平，具有清热解毒、健脾补气、润肺止咳之功效，民间用于治疗乳腺炎、胃及十二指肠溃疡、慢性气管炎、咳嗽、气喘、慢性咽喉炎、食物中毒等症［1］。甘草多糖(GPS)为甘草重要的活性成分之一［2］，具有抗补体和促有丝分裂等免疫调节作用［3］，尤其是免疫活性、抗氧化活性以及抗肿瘤活性都与其含量密切相关［4］。新疆甘草中以胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)资源最丰富，产量居全国之冠，是新疆商品甘草的最主要来源，主要分布在新疆天山以南的和田、喀什、阿克苏、巴音郭楞和哈密等地。2008年兵团农三师获得国家农业开发土地治理项目“新疆生产建设兵团农业三师1万hm2人工甘草基地”建设项目，至2011年甘草人工种植甘草面积已经达到1万 hm2［5-7］。目前，甘草多糖的研究报道较多，而针对采用响应面优化方法研究新疆胀果甘草多糖的研究报道较少。张琳［8］、赵春建等［9］、王航宇［10］等研究超声波提取温度、提取时间、液固比等因素对甘草多糖提取率的影响，并优化了提取条件。因此，通过对胀果甘草多糖的提取寻找新的具有高活性的甘草多糖仍然是多糖研究领域的一大重点和热点课题［11］。本实验以新疆胀果甘草多糖提取率为响应值，在单因素实验基础上，进行提取温度、提取时间和料液比的中心组合实验，拟合出多元线性回归方程，以获得新疆胀果甘草多糖提取的最佳工艺及其参数，为胀果甘草多糖的提取加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新疆胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)购于新疆石河子市农贸市场;无水乙醇、石油醚、硫酸、苯酚、葡萄糖等 均为分析纯。

MNMF-1818型谷物粉碎机 湖北碧山机械有限公司;T6型紫外可见分光光度计 湘仪集团;RE52-2旋转蒸发器 上海沪西分析仪器厂有限公司;722型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;FA1004A电子天平 上海精天电子仪器有限公司;微量加样器 上海大龙医疗设备有限公司;SSY型电热恒温水浴锅 北京泰克仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 基本工艺流程

1.2.1.1 粉碎、脱脂 甘草干品粉碎后过40目筛，按料液比1∶5(g∶mL)用石油醚回流脱脂1h，重复1次。

1.2.1.2 脱糖 将脱脂后的甘草粉末自然风干后，按料液比1∶5用80%乙醇溶液回流2h，重复1次，滤渣60℃烘干，蒸馏水90℃水提2h，将每次提取过滤所得的水提母液合并，浓缩至合适体积，使用玻璃透析袋流水透析3d。

1.2.1.3 脱蛋白 将浓缩液用15%三氯乙酸在4℃下搅拌脱蛋白。溶液经离心去沉淀，清液以1mol/L NaOH中和至中性，再流水透析3d。

1.2.1.4 浓缩 袋内溶液浓缩至适当体积，加入4倍于糖溶液体积的80%乙醇在4℃过夜沉淀并用80%乙醇清洗。

1.2.1.5 收集沉淀 离心收集沉淀，经乙醇和无水丙酮依次洗涤三次后冷冻干燥得到粗多糖。

1.2.2 胀果甘草多糖含量测定方法 采用苯酚硫酸法，参照参考文献［4-5］。

1.2.4 葡萄糖标准曲线的绘制 精确量取葡萄糖标准品溶液 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，置于标有 1、2、3、4、5号的干燥试管中并加水至2.0mL，再加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀，然后加浓硫酸(95.5%)5.0mL，充分摇匀，放置10min，沸水浴20min，同时设蒸馏水为空白对照，以上述确定波长进行扫描测定，测定其吸光度值，以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 甘草多糖提取条件的确定 依据参考资料［2，5，10］，取 过 40 目 筛 的 甘 草 粉 末 1g，提 取 时 间60min、料液比为 10∶1(mg∶L)、提取温度为 80℃为初始工艺参数，考察料液比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)、提取时间(30、50、70、90、110min)、提取温度(50、60、70、80、90、100℃)对胀果甘草多糖提取率的影响。

1.2.6 中心组合实验 在单因素实验基础上，选取料液比、提取时间和提取温度进行中心组合实验，并结合实际实验条件选取合理水平。以多糖提取率(Y)为响应值，并与建立的回归方程给出的预测值(Y＇)比较，通过响应面分析及对提取条件进行优化。中心组合实验因素与水平设计如表1所示。

表1 中心组合设计因素与水平表Table 1 Factors and levels in the central composite design

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线

葡萄糖的波长扫描图见图1。以λmax=475nm作为甘草多糖的最大吸收波长。在λmax=475nm处测定标准曲线，回归方程为y=0.0465x-0.007(R2=0.9992)的葡萄糖标准曲线见图2。

图1 葡萄糖的波长扫描图Fig.1 Scan map of glucose wave length

图2 葡萄糖标准曲线Fig.2 Standard curve of glucose

2.2 不同因素对胀果甘草多糖提取率的影响

提取时间对甘草多糖提取效果的影响如图3所示。在提取时间为70～90min时提取率较高，超过90min，胀果甘草提取率有所下降，考虑到浸提时间过长，有可能引起提取物结构的变化，同时可能会产生副产物，影响其功能性质，因此，选择提取时间75min，进行下一步实验;提取温度对甘草多糖提取效果的影响如图4所示，提取温度由50℃增加到90℃时，胀果甘草多糖提取随温度的上升而上升，当温度超过90℃后继续提高温度提取率变化不大，因此，选择90℃进行下一步实验;不同料液比对甘草多糖提取效果的影响如图5所示，胀果甘草多糖提取率随料液比的增大而增加，当料液比大于20∶1时，提取率不再增加，因此，选择料液比为20∶1进行下一步实验。

2.3 中心组合实验

图3 提取时间对甘草多糖提取率的影响Fig.3 Effect of time on extraction

图4 提取温度对甘草多糖提取率的影响Fig.4 Effect of temperature on extraction

图5 料液比对甘草多糖提取率的影响Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid on extraction

响应面设计的Box-Benhnken法具有实验次数少、精度高、预测性好等优点，常用于因素水平的优化。依据单因素实验结果，以料液比、提取时间和提取温度作为主要因素，设计三因素三水平响应面分析实验。共有15个实验点，其中12个为析因子，3个为零点。零点实验进行3次，以估计误差。中心组合实验方案及结果如表2所示。

表2 中心组合实验方案及结果Table 2 Central composite design matrix and experimental results

以胀果甘草多糖提取率为响应值，通过SAS统计软件的响应面回归方程对表2数据进行方差分析(表3)，建立多糖提取率(Y)的二次响应面回归模型，回归方程为:

回归方程的相关系数R2=0.9854，模型与实际拟合较好。模型的F值为37.54，p＜0.01，说明回归模型方程显著;CV值仅为0.57，说明实验操作可信。综上所述，此回归方程可用于胀果甘草多糖提取率的预测。

根据回归方程，分别绘制其中一个因素固定于零水平的条件下另外两个因素之间的响应曲面图，如图6所示。

表3 多糖提取率的二次多项回归模型方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the established Radix Glycyrrhiza ploysacchride yield

图6 各因素对甘草多糖提取率影响的响应面图Fig.6 Response surface plots for polysaccharide extraction ratio in the function of different parameters

2.4 最佳提取条件及实验模型的验证

通过软件分析得到的最大的响应值为10.59%，即胀果甘草多糖最大提取率为10.59%，与之对应的提取条件为:温度 92.4℃，时间 83.3min，料液比20.8∶1。考虑到实际操作的便利性，采用温度93℃，时间83min，料液比为21∶1为优化条件，进行3组重复实验。结果表明:模型得到最优条件下胀果甘草多糖实际平均提取率为10.48%，与预测的理论值相接近，说明模型有效且能够较好地反映出胀果干草多糖的提取条件，同时也说明了用响应面法优化胀果甘草多糖的提取条件是可行的。本实验所提取胀果甘草多糖主要为粗多糖，经测算其纯度为34.96%，与张琳［8］等提取的甘草多糖的纯度相比纯度较低，主要可能与甘草品种的不同有关，另外本实验未采用超声辅助提取也会对胀果甘草多糖的提取率及纯度产生影响，因此后续实验需要进一步纯化，并且考虑采用其他方式如超声波、微波辅助提取，以期提高胀果甘草多糖提取率及纯度。

3 结论

在单因素实验设计的基础上，对新疆胀果甘草多糖的提取条件进行了三因素三水平的响应面设计，建立了响应值和各个因素之间的数学模型，依据此数学模型确定的最佳提取工艺为温度93℃，时间83min，料液比21∶1。在上述最佳提取条件下，胀果甘草多糖提取率的实验值为10.48%。模型方差分析和响应面的分析表明，该模型回归极显著，对实验拟合较好，对油新疆胀果甘草多糖提取的工业化有一定应用价值。

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