突变型α-突触核蛋白对大鼠原代培养神经元突起生长作用研究

王 鹏 许 洁 李 昕 何 欣 李尧华 于 顺*

(1.北华大学基础医学院人体解剖学教研室，吉林132013;2.吉林化工学院理学院，吉林132022;3.首都医科大学宣武医院老年病研究所神经生物学研究室，北京100053)

神经退行性疾病(neurodegenerative disease)是一类以神经系统功能和结构逐步丧失和萎缩为特征的疾病，以阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)等为代表。PD是临床上最常见的神经系统退行性疾病之一，表现呈进展性，目前临床上尚无控制病程发展的有效措施，因此揭示这一疾病的机制，并采取早期诊断并预防显得日益迫切。

PD的病理特征为黑质多巴胺能神经元发生变性坏死，以及路易小体(Lewy body)和路易轴索(Lewy neurite)的形成［1-2］。Lewy body 和 Lewy neurite 是纤维淀粉样变的嗜酸性包涵体。人α-突触核蛋白(αsynuclein，α-Syn)是参与形成淀粉样变性的主要成分。α-Syn是一个具有140个氨基酸的蛋白质，主要分布于突触前膜和核膜［3-5］。α-Syn与细胞的信号转导有关，参与突触形成、维持和神经元的分化，对突触可塑性起一定的作用，但至今尚未完全清楚。为了阐明α-Syn在PD发病中的作用，有必要明确其生理功能。

体外实验［6］证明，α-Syn能够促进微管蛋白的聚合，加速微管的形成。在PD患者脑中，α-Syn被证明与γ-tubulin、tau蛋白以及MAP1B共存于Lewy body中，α-Syn可以促进原代培养的大鼠原代神经元的突起生长［7-9］。α-Syn与上述微管蛋白的密切关系及其潜在的促进微管形成的作用提示该蛋白有可能与神经元突起的形成和生长有关。本研究的目的是探讨比较α-Syn和其突变体对神经元突起生长的影响，为揭示其突变体A53T和A30P导致PD发病的机制提供线索。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

BCA蛋白质定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit)，购自 Pierce Biotech公司;α-Syn单克隆抗体3D5，由首都医科大学宣武医院神经生物研究室制备;FITC标记的羊抗鼠抗体，购自中山公司;细胞培养基DMEM(F-12)，购自Gibco公司;胎牛血清(FBS)和马血清(HS)，购自HyClone;蛋白相对分子质量标准，购自Pharmacia公司。其他均为化学分析纯试剂。

1.2 实验动物

新生24 h Wistar大鼠36只，雌雄不限，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，实验动物许可证:SCXK-(军)2002-001。

1.3 实验方法

1)重组蛋白的制备与纯化:将人α-Syn和其突变型 A53T、A30P的 cDNA分别插入表达载体 pET(3a)，然后转化至BL21(DE3)感受态细胞，在含氨苄西林的YTA培养液中培养，以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达。所表达的基因重组型蛋白采用离子交换层析和反向层析法纯化。纯化后的蛋白用SDS-PAGE法鉴定，BCA法定量。

2)原代神经元培养:按Kohn J Y等［10-11］创建的原代培养方法进行改良。将新生24 h大鼠断头，分离鼠脑，置于D-Hank's BBS中，剥去血管脑膜，分离皮质，剪碎。胰酶消化45 min后吹散，筛网过滤。800 r/min离心2 min后弃上清，细胞沉淀用DMEM培养基悬浮，计数细胞密度。以0.75×105个/皿的密度接种在用多聚赖氨酸包被好的培养皿(φ35 mm)中，加入相应蛋白进行分组培养。

3)神经元突起生长观察和长度测量:培养至第1、2和4小时，向培养皿中添加终浓度为1%的戊二醛。室温下固定1 h。随机挑选30个视野进行拍照，每个视野至少有5个存活的神经元［12］。采用10倍目镜，40倍物镜，黑白，照片分辨率1 300×1 030，格式为TIFF。应用Image-Pro Plus V2.0软件测量神经元突起的长度。

4)Western blotting法和免疫荧光法鉴定α-Syn的作用:将培养皿中的培养基吸弃，PBS冲洗。用细胞刮刮下细胞，超声破碎。功率200W，30s 2次，间歇30 s。破碎后的细胞溶液加入 SDS-PAGE Running Buffer，沸水中煮 5 min。4 ℃，12 000 r/min，离心 20 min。转移上清，取30 μL作为样品，进行SDS-PAGE。电泳结束后，转膜，脱脂奶溶液封闭，冲洗后，以1/1 000比例稀释的3D5抗体反应过夜。洗膜，再与1/5 000稀释的生物素标记的羊抗鼠抗体溶液反应。冲洗后，ECL法显示条带。

将培养细胞，以1%的戊二醛室温下固定1 h后，PBS冲洗培养皿。以含10%羊血清的PBST溶液，室温封闭1 h。弃封闭液，加入1/5 000稀释的3D5抗体1.5 mL。4℃过夜，PBST冲洗。加入1/500稀释的FITC标记羊抗鼠抗体，37℃，2 h;吸弃反应液，PBST冲洗。荧光显微镜下观察照相。

5)培养分组方案:向原代神经元培养基中添加终浓度为 20 μmol/L 的 α-Syn、突变型 A53T、A30P 和BSA，培养至第1、2、4小时观察。分别添加终浓度为20、40、60 和80 μmol/L 的相应蛋白，培养至4 h，观察突起长度变化。

1.4 统计学方法

采用SPSS 12.0统计学软件进行统计分析，所有数据均进行正态性检验，数据以均数±标准差(±s)表示。多组样本均数比较采用方差分析(One-way ANOVA)，方差齐者两两比较采用LSD检验，方差不齐者用TamhanepT2检验。两组比较采用t检验。两变量的相关分析采用Bivariate过程的Pearson直线相关法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组蛋白纯化鉴定结果

SDS-PAGE鉴定，经亲和层析得到纯度较高的α-Syn 和 A53T、A30P，详见图 1。

2.2 α-Syn可促进神经元突起生长，A53T、A30P不能促进突起生长

图1 纯化后蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.1 Purification of α-Syn

添加α-Syn(20 μmol/L)以及其他蛋白进行分组培养，培养至1 h、2 h和4 h固定观察。培养至1 h、2 h，添加α-Syn组的神经元突起平均长度大于对照组(P＜0.05)，而A53T组和A30P组与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。培养至4 h，α-Syn组神经元突起长度明显大于对照组(P＜0.01)，A53T组和A30P组与对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，见图2。添加不同浓度(20～80 μmol/L)的各蛋白，培养至4 h观察，α-Syn组突起长度随浓度增加而增加，而A53T组和A30P组无变化，见图3。可见α-Syn可以促进神经元突起生长，其突变型A53T、A30P对突起生长无影响。

图2 α-Syn和其突变体对神经元突起生长的影响Fig.2 Effect of α-Syn，A30P and A53T promote on the neurite outgrowth

2.3 α-Syn可以从培养基进入神经元内，A53T和

A30P不能转入神经元

α-Syn组神经细胞裂解液Western blotting结果现清晰条带，为阳性;A30P、A53T和对照组均为阴性，图4A。免疫荧光实验结果显示α-Syn神经元显色清晰，在细胞内呈广泛、均匀分布，对照组、A53T和A30P组为阴性，见图4B。可见α-Syn可以从培养基进入神经元内，A53T和A30P不能进入神经元。

图3 α-Syn组突起长度随浓度变化情况Fig.3 α-Syn promotes neurite outgrowth of primary rat brain neurons in a dose-dependent manner.

图4 α-Syn向细胞内的转运Fig.4 Transportation of α-Syn into primarily cultured neurons

3 讨论

在原代培养的神经细胞生长初期，微管(microtubule)在神经细胞的轴突和树突中起支撑作用，帮助突起生长。在成熟的神经元中，微管是物质运输的途径，参与神经递质的传递。体外研究［6，13-14］证明，α-Syn具有与tau蛋白相似的作用，可以促进微管蛋白组装成微管。我们研究发现通过促进微管的组装，α-Syn可以促进大鼠原代神经元突起的生长，这一作用提示该蛋白很可能参与神经系统早期发育阶段神经元突起的形成以及中枢神经系统损伤后的修复［9，15-16］。而突变体 A53T和 A30P则失去这种有序的微管组装功能，在家族PD患者的脑神经元受到某种致病因子损伤后，由于伴侣蛋白的突变，影响微管的合成和有序排列，致使神经元突起修复和重建障碍或轴浆转运紊乱，导致细胞间或细胞内无定形物的形成聚集。促微管聚合的作用的丧失，可能影响神经系统的早期发育以及中枢神经系统损伤后的修复，对揭示α-Syn突变导致神经元退变的机制也有重要意义。因此我们以原代培养神经元为观察对象，研究α-Syn突变体对神经元突起生长的影响。

实验结果显示，在原代神经元培养4 h内，α-Syn可促进突起生长，A53T和A30P对突起生长无影响。Sung J Y等［17］实验发现α-Syn抑制H19-7大鼠海马神经祖细胞的增生。我们的实验结果显示，α-Syn对神经元生长的影响仅限于突起的生长，对神经元胞体的大小、形态没有影响。Western blotting结果显示添加α-Syn组细胞内蛋白免疫反应呈阳性，A53T组、A30P组和对照组同为阴性。免疫荧光印迹结果显示，α-Syn在神经元的胞体和突起呈现轮廓清晰的绿色荧光，这说明外源性的α-Syn在胞体和突起均有分布，分布广泛、均匀。这与微管在细胞内的分布一致，提示进入细胞的α-Syn与微管蛋白之间存在伴侣关系。α-Syn分子含有7个KTKEGV不完全重复序列，该序列能够介导α-Syn过细胞膜［18-19］。其N端1～60氨基酸，就含有4个重复的KTKEGV残基，而30和53位的错义突变导致α-Syn的构象改变不能进入神经元，失去与微管蛋白结合促突起生长的能力。目前，α-Syn与微管蛋白之间的共同作用关系正成为解释PD病因的新的研究热点。此研究结果为揭示α-Syn的功能，及其与微管蛋白的关系提供了新证据，对突变型α-Syn导致PD的病因、病理机制阐述提供了新思路。

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