多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-1介导高糖致大鼠肾脏系膜细胞tPA/PAI-1的紊乱

朱恒梅，祝胜郎，陈结慧，叶 玲，蒋 莹，李向阳

(深圳市第六人民医院肾内科，广东 深圳 510082)

多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-1介导高糖致大鼠肾脏系膜细胞tPA/PAI-1的紊乱

朱恒梅，祝胜郎*，陈结慧，叶 玲，蒋 莹，李向阳

(深圳市第六人民医院肾内科，广东 深圳 510082)

目的 探讨多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-1(PARP-1)在高糖(25 mmol/L)作用下大鼠肾脏系膜细胞tPA/PAI-1纤溶系统紊乱中的作用。方法(1)体外培养大鼠肾脏系膜细胞株(MCs 1097)，使用高糖(25 mmol/L)处理大鼠肾脏系膜细胞，部分实验组中应用PARP-1特异性抑制剂PJ34(3×10-6mol/L)进行干预处理。(2)RT-PCR及Western blot检测PARP-1的mRNA及蛋白表达。(3)高通量比色测定法检测PARP-1的活性。(4)ELISA法测定细胞上清液tPA、PAI-1的分泌蛋白。结果(1)高糖显著诱导大鼠肾脏系膜细胞PARP-1 mRNA和蛋白的表达，PJ-34可明显抑制高糖诱导的PARP-1 mRNA和蛋白的过度表达。同时，高糖显著诱导大鼠肾脏系膜细胞PARP-1激活，PJ-34可显著抑制高糖诱导的PARP激活。(2)高糖轻度减少大鼠肾脏系膜细胞分泌型tPA的蛋白表达，显著增加大鼠肾脏系膜细胞分泌型PAI-1的蛋白表达，导致tPA/PAI-1比值降低，PJ-34显著预防高糖诱导的上述改变。结论高糖可以诱导培养的大鼠肾脏系膜细胞内PARP激活，PARP1表达增加，PJ-34预处理可以明显降低高糖诱导的大鼠肾脏系膜细胞内PARP的激活以及下游tPA/PAI-1纤溶系统紊乱，提示高糖可能通过过度激活PARP来诱导tPA/PAI-1功能紊乱。

系膜细胞；PARP；高糖；tPA/PAI-1；纤溶系统

PARP是一类存在于多数真核细胞中的蛋白质翻译后修饰酶，能选择性识别并结合DNA缺口的DNA结合蛋白酶，具有保持染色体结构完整、参与DNA复制和转录的功能，在维持基因组稳定和细胞死亡过程中发挥作用[1-2]。高血糖介导的活性氧(ROS)可以激活多聚ADP核糖聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]，提示其在糖尿病病程中可能发挥作用。组织型纤溶酶原激活物/纤溶酶原激活物抑制物-1(tPA/PAI-1)是主要的纤溶酶原/纤溶酶系统，不仅能直接降解细胞外基质，还能激活金属蛋白酶间接降解基质，处于各种调节酶系的上游，在糖尿病肾小球硬化中发挥重要作用。肾小球系膜细胞是糖尿病肾病(DN)损伤的中心环节，因此本实验以大鼠肾脏系膜细胞作为研究对象，探讨多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-1(PARP-1)在高糖致tPA/PAI-1紊乱中的作用，以探讨PARP在糖尿病肾病发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 D-Glucose购自Sigma公司，PJ-34购自默克公司；细胞培养用RPMI 1640，胎牛血清购自Gibco公司；Trizol溶液购自美国Invitrogen公司；胰岛素购自甘李药物公司，Trizol Reagent购自Invitrogen公司；细胞裂解液、HRP标记的兔抗大鼠Ⅱ抗购自Cell signaling公司，兔抗大鼠PARP-1一抗购自CHEMICON公司；tPA、PAI-1酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司；PARP/ Apoptosis检测试剂盒购自trevigen公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA逆转录试剂盒购自Fermentas公司，Taq DNA聚合酶购自Takaka公司。其余化学试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组大鼠肾脏系膜细胞株(MCs 1097，购自美国ATCC公司)培养于含有15%胎牛血清及0.6 U/ml胰岛素的RPMI 1640培养基中。细胞培养至85%融合后，换用无血清培养基培养24 h，后换用新鲜无血清的DMEM低糖(5 mmol/L)培养基，分别加入药物刺激干预：高糖刺激组中高糖浓度为25 mmol/L，刺激时间为24 h。PJ34干预组先给予3× 10-6mol/L PJ34孵育1h后，加入高糖刺激24 h。单纯使用PJ34组作为对照。

1.2.2 细胞总蛋白提取 细胞用PBS清洗后加入细胞裂解液，冰上放置5 min。用细胞刮刮取细胞，收集至1.5 ml Eppendorf管中，放置于冰上。用超声粉碎仪在冰上进行超声粉碎，500 W、1 s×15次，以剪切DNA，降低黏稠度。4℃，12 000 r/min离心10 min，留取上清。取10 μl上清测定浓度，余储存于-80℃备用。细胞总蛋白提取物做Western blot分析高糖对于大鼠肾脏系膜细胞PARP-1表达的影响。

1.2.3 RT-PCR 大鼠肾脏系膜细胞总RNA的提取按照Trizol说明书操作。RT-PCR引物购自美国INVITROGEN公司上海分部。逆转录反应及RT-PCR反应：取1.0 μg的总RNA采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，以Oligo(dT)18为引物合成第一链cDNA(按试剂盒说明书进行)；②PCR：采用Takaka公司试剂盒PCR反应扩增。引物序列如表1。产物储存于-20℃。取8 μl PCR产物在含有0.5 μg/ml溴化乙淀(EB)的1.5%琼脂糖凝胶中以85 V恒压电泳30 min，紫外检测仪上观察，用凝胶图像成像系统成像及进行扫描定量分析DNA带的含量，以所测得积分吸光度与内参照β-Actin积分吸光度的比值代表半定量值。PARP-1及β-Actin引物及反应条件见表1。

表1 PCR引物合成序列

1.2.4 细胞培养液上清中tPA PAI-1的含量按照ELISA试剂盒(上海太阳生物技术有限公司)说明书进行。

1.2.5 PARP活性检测 细胞PARP活性检测按照PARP/Apoptosis检测试剂盒(trevigen公司)说明书进行。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，各组数据之间差异显著性用多个样本均数比较及两两用ANOVA方差分析检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PJ34抑制高糖诱导大鼠肾脏系膜细胞PARP-1的过表达 应用高糖刺激大鼠肾脏系膜细胞，高糖组系膜细胞PARP-1 mRNA和蛋白的表达较较低糖对照组明显增加，分别较低糖对照组增加72.3%和68.4%(P＜0.05)，PJ34组系膜细胞PARP-1 mRNA和蛋白的表达分别减少为高糖组的31.8%和55.5%(P＜0.05，见图1，图2)。单纯使用PJ-34不影响系膜细胞PARP-1的表达。同时，高糖显著诱导大鼠肾脏系膜细胞PARP-1激活，高糖组为对照组活性的1.77倍(P＜0.05)，给予PJ-34预处理可显著抑制高糖诱导的PARP激活，活性降低为高糖刺激组的67.8% (P＜0.05，见图3)。

2.2 PJ34 抑制高糖诱导大鼠肾脏系膜细胞上清液tPA及PAI-1蛋白的过表达 应用高糖刺激大鼠肾脏系膜细胞，高糖组系膜细胞分泌的tPA蛋白显著下降，较低糖对照组下降30.0%(P＜0.05)，分泌的PAI-1蛋白明显增加，较低糖对照组增加70.7%(P＜0.05)，tPA/PAI-1比值较低糖对照组减少41.0%(P＜0.05)。PJ34组系膜细胞分泌的tPA蛋白有所增加，较高糖组增加30.8%(P＜0.05)，分泌的PAI-1蛋白则较高糖组明显下降，为高糖组的73.2%(P＜0.05)，tPA/PAI-1比值则较高糖组增加78.6%(P＜0.05，见图4)。单纯使用PJ-34不影响系膜细胞上清液tPA及PAI-1蛋白的表达。

图1 高糖(25 mmol/L)诱导PARP-1 mRNA表达及PJ34的干预作用

图2 高糖(25 mmol/L)诱导PARP-1蛋白表达及PJ34的干预作用

图3 高糖(25 mmol/L)诱导PARP-1活性表达及PJ34的干预作用

图4 高糖(25 mmol/L)诱导tPA、PAI-1蛋白的过表达及PJ34的干预作用

3 讨论

DN是糖尿病严重的并发症之一，也是发达国家终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)的首要原因，我国近年来发病率也有不断上升的趋势[3]。糖尿病肾病早期的病理变化主要表现为：肾小球系膜基质增宽及毛细血管基底膜增厚，后期出现肾小球硬化及肾间质纤维化。糖尿病肾病的发病过程中，细胞外基质(ECM)堆积是其病理损害的关键。ECM的过度积聚可以导致肾小球系膜膜基质增厚，肾小球肥大，进而导致肾小球硬化。ECM的产生增加和(或)降解减少是ECM积聚的主要原因。ECM主要包括胶原(Collagen，COL)，层粘连蛋白(Laminin，LN)，纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)[4-5]。笔者未发表的数据再次证实了高糖显著增加COLⅣ和FN表达。tPA/PAI-1是主要的纤溶酶原/纤溶酶系统，PAI-1是tPA的天然抑制剂，糖尿病时，tPA/PAI-1功能紊乱，导致tPA表达减少，PAI-1表达增多，抑制了纤溶系统的功能，使纤溶酶酶原活化减少，纤维蛋白/纤维蛋白原降解减少，ECM降解受到抑制，在糖尿病ECM积聚中发挥重要作用[6]。在本研究中，我们同样观察到应用高糖刺激大鼠肾脏系膜细胞，高糖组系膜细胞分泌的tPA蛋白有所下降，PAI-1蛋白明显增加，tPA/PAI-1比值降低，再次证实糖尿病时tPA/PAI-1功能紊乱。

研究表明，高糖损伤的细胞类型都具有一致的特点，都有ROS的生成增多[7]。高血糖介导的ROS通过在过度激活PARP来抑制关键的糖酵解酶GAPDH，引起糖酵解的中间产物大量堆积，其中，增加的中间产物3-磷酸甘油醛激活了AGE途径和PKC途径[8]。另一种中间产物6-磷酸果糖使得己糖氨通路流量增加[9]。最终，GAPDH的抑制使得糖酵解的第一步代谢物—葡萄糖水平升高。高糖可增强羟基化途径，降低醛糖还原酶活性，从而激活多元醇途径[10]。而Suzuki等[11]证实高糖诱导PAI-1基因表达部分是通过PKC途径；也有报道指出，高糖也能经己糖氨通路及AGE途径促进PAI-1基因表达[12]。因此，我们可推断高糖通过过度激活PARP来诱导tPA/PAI-1功能紊乱。

PARP是一类存在于多数真核细胞中的蛋白质翻译后修饰酶。主要存在于细胞核内，少量存在于细胞浆内。它是能选择性识别并结合DNA缺口的DNA结合蛋白酶，主要通过修复DNA单链及双链断裂在维持基因组的完整性方面发挥作用[1]。我们既往研究发现抑制PARP可以显著改善高糖所致腹膜间皮细胞的PAI-1的表达，进而抑制其转分化及纤维化[13]。我们还发现下调PARP-1活性及表达能部分逆转AngII诱导的大鼠肾脏系膜细胞PAI-1的表达并抑制细胞外基质积聚[14]。而在本研究中，我们发现高糖刺激可以引起大鼠系膜细胞细胞内PARP激活，PARP-1表达升高以及分泌的tPA蛋白有所下降，PAI-1蛋白明显增加，tPA/PAI-1比值降低，提示tPA/PAI-1功能紊乱。我们还首次发现应用PARP抑制剂PJ34干预后大鼠系膜细胞PARP-1活性及表达降低，明显改善了高糖诱导的FtPA/PAI-1功能紊乱。首次证实了高糖可能通过过度激活PARP来诱导tPA/PAI-1功能紊乱。因此，研究和开发PARP抑制剂，将为临床治疗氧化应激相关性疾病提供新策略和新方法,为糖尿病肾病的治疗提供一个新的思路。

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Effect of Poly(ADP-ribose)Polymerase-1 in high glucose-induced disorder of of tPA/PAI-1 in rat mesangial cells.

ZHU Heng-mei,ZHU Sheng-lang,CHEN Jie-hui,YE Ling,JIANG Ying,LI Xiang-yang.

Department of Nephrology,the Sixth Hospital of Shenzhen City,Shenzhen 510082,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the role of Poly(ADP-ribose)Polymerase-1(PARP-1)in high glucose-induced disorder of tPA/PAI-1 in rat mesangial cells(RMCs).MethodsRMCs were constructed and then treated with or without high glucose(25 mmol/L).In some experimental groups,cells were pre-treated with PARP-1 inhibitor PJ34(3×10-6mol/L).RT-PCR was employed to detect the expression of PARP-1 mRNA,Western blot was used to detect the expression PARP-1 protein,and Colorimetric assay for its activity.Meanwhile,tPA and PAI-1 protein secretion were examined by ELISA.ResultsHigh glucose significantly stimulated the overexpression of both PARP-1 mRNA and protein in RMCs.At the same time,high glucose obviously stimulated PARP-1 activation,and PJ34 effectively inhibited the activation of PARP-1.Also,PJ34 suppressed high glucose-induced downregulation of tPAprotein secretion,upregulation of PAI-1 protein secretion and reversed the reduction of tPA/PAI-1 ratio.ConclusionPARP-1 mediates high glucose-induced disorder of tPA/PAI-1 in rat mesangial cells.

Mesangial cells;PARP;High glucose;tPA/PAI-1;Fibrinolytic system

R-322

A

1003—6350（2012）20—018—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.20.007

2012-05-17)

深圳市科技局科技立项(编号：201102134)；深圳市南山区计划项目(编号：南卫2011004)

朱恒梅(1970—)，女，江西省赣州市人，主治医师，博士。

*通讯作者：祝胜郎，男，主任医师，硕士导师。E-mail：zhushenglang@yahoo.com.cn