两种方法分离培养类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞的比较

蔡文虹 孙保东 张宝凤 成文翔 岳野 虎义平 李金超 张鹏

[摘要] 目的 比较体外分离培养成纤维样滑膜细胞（FLS）的方法。 方法 滑膜组织来自关节镜清洗术的活动期类风湿关节炎患者，分别采用消化酶培养法、组织块培养法分离培养FLS。采用倒置相差显微镜以及流式细胞术对第3～4代FLS进行鉴定。 结果 2种原代分离培养的方法均可成功培养出FLS。传代可使FLS达到形态学上的纯化要求，倒置相差显微镜观察均符合FLS的形态结构特征，流式细胞术检测示CD44以及CD90呈强阳性，CD55呈弱阳性。组织块法培养法FLS成功率较高，细胞游出时间较早，细胞损伤小。 结论 组织块培养法适合于FLS的培养，第3～4代细胞的数目、活性及纯度符合进一步实验的要求。

[关键词] 成纤维样滑膜细胞；细胞培养；分离培养；类风湿性关节炎

[中图分类号] R-33[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2012）07（c）-0013-03

Comparative of two methods for rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells isolation

CAI Wenhong1 SUN Baodong1 ZHANG Baofeng2 CHENG Wenxiang3 YUE Ye3 HU Yiping3 LI Jinchao3ZHANG Peng3

1.Department of Rheumatology, Shenzhen People′s Hospital in Guangdong Province, Shenzhen 518020, China; 2.Department of Nutrition, Shenzhen People′s Hospital in Guangdong Province, Shenzhen 518020, China; 3.Center for Translational Medicine R&D;, Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Science, Guangdong Province, Shenzhen 518055, China

[Abstract] Objective To compare the isolated methods for fibroblast-like synoviocytes (FLS). Methods Synovium tissue obtained from patients with active rheumatoid arthritis by digestive enzyme culture and tissue culture. The 3～4 generation FLS were identified by morphology and flow cytometry. Results These two methods could culture FLS successfully, tissue culture method was better than the digestive enzyme culture method. FLS showed typical morphological characters under inverted phase contrast microscope. CD44 and CD90 were strong positive, and CD55 was weak positive in the FLS cell surface. Tissue culture method had higher successful rate with earlier and more quickly cell emigration from synovium tissue. Conclusion Tissue culture method is especially suitable for FLS culture in vitro from synovium tissue. And purity of FLS of the third or forth generation meet the requirement for molecular biology experiments.

[Key words] Fibroblast-like synoviocyte; Cell culture; Separate training; Rheumatoid arthritis

類风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、炎性、系统性的自身免疫性疾病[1]。该疾病主要侵犯全身各处关节，呈多发性慢性增生性滑膜炎，可破坏关节软骨和关节囊[2-5]。而其病因至今仍未明确，为明确类风湿性关节炎的病因，发病机制以及寻找新的治疗方法，滑膜组织为重要的研究对象。

成纤维样滑膜细胞（fibroblast-1ike synoviocyte，FLS）是滑膜组织中的重要的组成细胞，可通过自分泌或旁分泌方式产生大量的炎性细胞因子及免疫反应介质，是参与RA发病的重要细胞[6]。建立FLS体外培养模型对于FLS功能的研究、进一步探讨RA的发病机制及研发新的RA的药物具有重要意义[7]。目前用于 FLS体外培养的滑膜多来自关节开放性手术、关节镜手术、从滑液中分离等方法[8]。本研究对比经典的消化酶培养法与组织块培养法进行的原代培养，比较获得体外培养滑膜组织FLS的最佳方法。为之后的其他研究型试验做基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 滑膜組织在患者知情同意的情况下，滑膜组织取自关节镜清洗术中的活动期的RA患者， RA诊断符合1987年美国风湿病协会（Am can College of Rheumatology，ACR）修订的诊断标准。

1.1.2 主要试剂DMEM培养基、2.5 g/L胰酶EDTA （美国GIBCO公司）；胎牛血清（fetal bovine sell，In，FBS），I型胶原酶、PBS缓冲液、鼠抗人CD44单克隆抗体、鼠抗人CD90单克隆抗体、鼠抗人CD55单克隆抗体（BD Pharmingen公司）。

1.2 方法

1.2.1 消化酶培养法将关节镜手术中获取的滑膜组织采用眼科剪剪碎，加入Ⅰ型胶原酶（1 mg/mL）混匀，于37℃、5%CO2细胞培养箱中消化2～4 h；采用100 μm孔径大小的细胞滤网过滤、离心，留取沉淀，加入含10% FBS的DMEM培养液重悬细胞，移入人细胞培养瓶中培养；每2～4天换液一次。

1.2.2 组织块培养法将关节镜手术中获取的滑膜组织剪成1 mm 大小，而后将组织块均匀排列在培养瓶的培养面。加入含10% FBS的DMEM培养液，使培养液刚刚没过组织块表面，先置于培养箱中孵育过夜后，添加一定量的培养液培养；每2～4天换液1次。观察到组织块周围有FLS细胞爬出，且融合成片后，剔除组织块，继续培养。

1.2.3 倒置显微镜观察观察细胞原代以及传代后的细胞形态以及生长情况。

1.2.4 流式细胞术检测细胞表面标记物的表达情况细胞传至3～4代时，将其消化制成1×10⁵/mL的单细胞悬液，分别加入鼠抗人CD44，CD55，CD90单克隆抗体予以染色，而后采用流式细胞技术检测这些表面标志物的表达情况。

2 结果

2.1 组织块培养法与酶消化培养法分别分离培养FLS的比较

组织块贴壁后，可见FLS从组织块边缘游出。经过反复贴壁与传代后，3～5代滑膜细胞逐渐纯化，主要以成纤维样细胞为主，体外生长稳定，镜下观察细胞形态基本为长梭形，少数为星形、多角形，胞质透亮、均匀，核居中，排列有局部方向性。在10例细胞培养中，酶消化培养法与组织块培养法各5例，酶消化法成功3次，组织块培养法成功4次。组织块培养法比酶消化法（图1）组织块贴壁更快，且细胞生长迅速 （图2）。

2.2 FLS的鉴定

倒置相差显微镜下观察可见FLS呈三角形，梭形，细胞核成卵圆形，位于细胞中央，核仁清晰，细胞周围可见分泌物聚集。流式细胞术结果显示，绝大多数细胞表面CD44与CD90呈强阳性，CD55在细胞表面的表达呈弱阳性（图3）。

3讨论

研究发现，RA的免疫活动主要发生在滑膜。在活动性RA患者中，可见滑膜充血，水肿，大量的免疫细胞浸润，滑膜细胞也随之增生，增生的滑膜细胞具有一定的免疫细胞的特性，可分泌炎症因子，加剧RA的进展。成纤维样滑膜细胞在RA疾病的发病，进展以及疾病的治疗中都起着重要的作用[9-10]。鉴于FLS在研究中的重要性， FLS的分离培养成为RA相关研究的重要组成部分。获取符合条件的滑膜组织后，获得均一纯化的FLS有较高的技术要求[11]。

本实验主要比较了两种分离培养FLS的方法：组织块培养法与酶消化法。与酶消化方法相比，组织块培养法在实验过程中，操作简单，因为无胶原酶的消化，缩短了分离操作的时间，同时避免了蛋白酶对细胞的损伤，简便的操作步骤尽可能的减少了污染的机会。从而有利于细胞的贴壁以及生长。FLS 具有可贴壁生长且贴壁能力较强的特性，这一特性有助于去除原代培养中存在的巨噬细胞样细胞以及杂质，可通过传代将其纯化。

分离培养后，采用流式细胞技术，鉴定了一组细胞表面的标志物CD44，CD55以及CD90。文献报道这类表面标志物可表达在成纤维样细胞表面。可用于区别巨噬细胞样滑膜细胞[12-13]。在的笔者的结果中CD44与CD55均为强阳性，可认为巨噬细胞、滑膜下层成纤维细胞的比例极低，即所获得的细胞绝大多数为成纤维样滑膜细胞。

笔者的实验结果以及文献报道均提示，原代培养的FLS，在1～2代纯度不够，超过5代之后，细胞趋于老化，生长缓慢，7～8代之后完全失去细胞增殖的活性，细胞形态也发生较大的改变。因此，对于采用原代FLS为研究对象的实验研究，建议采用第3～4代FLS进行实验。

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（收稿日期：2012-06-13本文編辑：林利利）