大鼠表皮干细胞分离培养的方法研究

摘要：目的是探讨大鼠表皮干细胞的分离培养的方法。方法主要以0 ～7日龄SD大鼠为材料，采用中性蛋白酶和胰蛋白酶分离表皮细胞，IV型胶原黏附法对分离的表皮干细胞进行培养，观察其形态、生长情况。结果是培养后的表皮干细胞胞质近中央处有圆形核并开始形成小克隆，细胞即连接成片，紧密相靠，相互衔接，呈铺路石状。结论为该方法分离培养的表皮干细胞纯合，呈现典型的上皮型细胞形态，可用于皮肤的再生修复。

关键词：表皮干细胞；细胞分离；细胞培养

中图分类号： Q593. 2 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2014）-18-17-1

表皮干细胞也可称角质干细胞，不同部位的表皮干细胞分布存在差异，其主要分布于表皮基底层和毛囊外根鞘隆凸部及皮脂腺边缘[1]。表皮干细胞在维持皮肤的自我更新、创伤修复、皮肤肿瘤的发生等方面扮演着重要的角色，因此成功地分离、培养表皮干细胞对临床上创伤修复、皮肤癌的研究起着至关重要的作用[2]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及用具

1.1.1实验材料 0～7日龄SD大鼠。

1.1.2实验试剂 中性蛋白酶，胰蛋白酶-EDTA消化液，IV型胶原，DMEM培养液，D-Hanks，KSFM培养液，冻存液，75%酒精。

1.1.3实验用具 剪刀、镊子、尼龙纱网、手术刀、培养瓶、培养皿、冻存管、水浴锅、CO2培养箱、超净工作台，电子显微镜，离心机等。

1.2 实验方法

1.2.1表皮细胞的分离 取0 ～7日龄SD大鼠，脱颈锥处死， 75%酒精清洗，剪取背部皮肤，D-Hanks清洗，将其切割为0.5×1.0厘米的皮肤组织，0.25%中性蛋白酶在4℃处理12～16小时，吸弃上清液，D-Hanks清洗后分离表皮和真皮。表皮剪碎呈糜状，以2.5克/升胰酶+0.2克/升 EDTA消化液在37℃条件下消化5～10分钟，用含小牛血清的DMEM培养液终止消化，吹打至悬液，100目尼龙纱网过滤，1000转/分钟离心5分钟，弃上清液，以培养液重悬制成单细胞悬液。

1.2.2 胶原黏附法选择表皮干细胞 将单细胞悬液以2×105 个/毫升的密度接种在铺被IV型胶原的培养瓶内，37℃、5%CO2培养箱中孵育10～15分钟。吸出细胞悬液，粘附在胶原被膜上的细胞则为表皮干细胞。

1.2.3 表皮干细胞培养 在去除细胞悬液铺被IV型胶原的培养瓶中加入无血清角质形成细胞培养基（KSFM）进行培养，12小时后换液以除去未贴壁的细胞，以后每2天换液一次，光学显微镜下观察细胞生长情况。

2 结果与分析

2.1 原代培养的表皮干细胞

刚刚接种的表皮干细胞，细胞均匀分散呈圆形，核大，胞体小，培养一周（图1）进入增殖期，第12天达到高峰表皮干细胞渐渐伸展形成扁平的多角状，胞质近中央处有圆形核并开始形成小克隆，细胞即连接成片，紧密相靠，相互衔接，呈铺路石状，汇合成片。

2.2 传代培养的表皮干细胞

原代细胞接种24小时后即伸展，相互聚集，粘附在胶原上，呈克隆样生长，细胞聚集在集落中心周围呈辐射状生长，5～6天表皮干细胞增殖能力加强，达到融合铺满培养瓶的瓶底。

3 结语

不同的细胞外基质对细胞的黏附作用不同，表皮干细胞主要通过表达整合素实现其对基底膜的粘附，同时也是干细胞维持其特性的基本条件。IV型胶原作为细胞外基质的主要成分对细胞的粘附、生长、移行等方面起重要作用，表皮干细胞不仅对IV型胶原有较强的粘附性，而且在IV型胶原上能很好的生长，由此进行筛选、培养、纯化表皮干细胞，结果表明，获得的表皮干细胞较纯净，其仍具有较强的分裂增殖能力，于培养后第二天，大量克隆细胞形成，5～6天汇合成片，可以长期传代。该方法操作简便，表皮干细胞生长良好，具有较高的克隆形成率。

无血清培养基及其附加的营养成分在细胞生长与培养液之间提供了较好的平衡体系，有利于表皮干细胞的增殖及其表型的维持，由于培养基中不含血清，没有血清中的各种复杂和不明的成分，排除血清中许多未知因素对干细胞分化的影响，是目前培养表皮干细胞被认可的方法[3]。

参考文献

[1] 孙晓燕，付小兵，孙同柱.表皮干细胞的分离培养和鉴定，中华实验外科杂志[J]，2007，24（2）：163-164.

[2] 王海燕.肺出血·肾炎综合征抗基底膜抗体型.北京人民卫生出版社[M]，1998：912-922.

[3] 刘德伍，陈国安，曹勇，等.人表皮细胞无血清培养的实验研究[J]，1997，13（6）：419-420.

作者简介：冯颖，硕士学历，通化师范学院生命科学学院，讲师，研究方向：生物技术。