海南黎族哮喘ORMDL3基因多态性研究

丁毅鹏，何海武，石慧芳，林 莉，陈 山，姚红霞

（1.海南省人民医院急救中心，海南 海口 570311；2.海南省农垦总医院，海南 海口 570311）

哮喘是一种慢性支气管炎疾病，现全世界大约有1亿多人患病[1-2]。哮喘是由基因、环境因素等共同作用下导致的疾病。近年来研究表明，17号染色体基因单核苷酸多态性(SNPs)与多个民族的哮喘易感性相关，可能是另一个与哮喘基因可能为一个新的哮喘相关基因[3]。本研究选择了该基因上两个多态性位点rs7216389和rs11650680，分析海南黎族人群哮喘基与ORMDL基因多态性间的关系，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 120例哮喘患者均为海南黎族，年龄18～72岁，平均（53.6±6.9）岁；男性62例，女性58例。2005-2007年海南黎族支气管哮喘现况研究中确诊及在当地医院住院或门诊的哮喘患者，均符合1997年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组支气管哮喘的诊断标准[4]。对照组150例均为健康黎族成人，经胸部X线检查、肺功能测定排除有肺部等呼吸系统疾病，排除心、脑及内分泌等疾病，最近2个月无感染史，1周内无使用过任何药物。年龄20～73岁，平均（50.3±5.9）岁，男性79例，女性71例。哮喘组与对照组两组间年龄、性别及居住环境比较差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 模板DNA的制备及PCR方法 基因组DNA从研究对象空腹静脉血中用酚氯仿提取，通过聚合酶链反应(PCR)扩增目的DNA。ORM2DL3基因rs7216389上游引物为：5'-GGTGGGGTGGCTCACGCCTG2TAATC-3'；下 游 引 物 5'-TTGTCTTT GGAAATCCAGC2CCTGCC-3'；rs11650680 上 游 引物为：5'-TTACCGGGTTTACGGTTGG A-3'；下游引物为：5'-TCCAACCGTAAACCCGGTAA-3'[5]。PCR总反应体积为50 μl；无菌去离子水30 μl，10×反应缓冲液5 μl，MgCl2溶液(215 mmol/L)3 μl，4×dN TP 混合物4 μl，上、下游引物各4 μl，Taq 酶2 μl，模板DNA 2 μl。PCR 循环条件：95℃预变性60 s，95℃变性50 s，58℃退火50 s，72℃延伸75 s，循环30次；72℃后延伸10 min。

1.2.2 限制性内切酶酶切及基因型的鉴定 反应总体积25 μl，无菌去离子水10 μl，Buffer G反应缓冲液5 μl，BSA(10g/L)(Promega 公司)2 μl，限制性内切酶NspⅠ10 IU，37℃水浴14 h过夜。个体DNA样本经PCR扩增后以2%琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭染色，在紫外灯下观察结果。

1.2.3 rs7216389和rs11650680位点基因型相关性分析 按照基因型的不同对rs7216389所有研究对象分为TT基因型、TC基因型和CC基因型和rs11650680所有研究对象分为CC基因型、CT基因型和TT基因型进行统计。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件对数据进行分析，样本数据用均数±标准差（±s）表示，率间的比较采用χ2检验方法进行，相关性分析采用Spearman分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR反应产物及酶切产物结果判定 从图1可见，ORMDL3基因rs7216389位点CC型PCR反应产物片段长度约为520 bp，TT型约为320 bp和 280 bp，TC 型 为 520 bp、320 bp和 280 bp；ORMDL3基因rs11650680位点CC型PCR反应产物片段长度约为600 bp，TT型约为250 bp和180 bp，TC型为600 bp、250 bp和180 bp。

图1 PCR反应产物及酶切产物结果

2.2 ORMDL3基因rs7216389位点基因型分布 从表1可见，rs7216389位点基因型在哮喘组与对照组分布有差异，其中以TT型差异具有统计学意义（P＜0.05）。经spearman分析，TT基因型与哮喘呈正相关（r=0.775，P＜0.05）。

表1 rs7216389位点基因型分布[例（%）]

2.3 ORMDL3基因rs11650680位点基因型分布 从表2可见，rs11650680位点基因型在哮喘组与对照组分布有差异，其中以TT型和CC型具有统计学意义（P＜0.05）。经spearman分析，TT和CC基因型与哮喘呈正相关（r分别为0.674和0.853，P均＜0.05）。

表2 RMDL3基因rs11650680位点基因型分布[例（%）]

3 讨论

ORMDL基因是2002年在科学家对色素性视网膜炎进行基因测序时发现的，属于一种全称为ORM1-like gene family的新基因家族。该家族可在酵母、脊椎动物等中表达，而在人类中，其由3个成员基因(ORMDL1、ORMDL2和ORMDL3)组成。ORMDL基因家族非常保守，人类ORMDL同系物可以使酵母突变体恢复功能[4]。ORMDL基因，尤其是ORMDL3基因已被多项研究证明其与哮喘相关性强[6-7]。但也有研究发现，ORMDL3基因SNP在不同人种中表达可能存在一定差异。有研究发现，ORMDL3基因中的SNP rs7216389与苏格兰青少年哮喘易感性及病情恶化相关[8]；而在Galanter等[9]的研究中，不同人种ORMDL3基因中的SNPs(rs4378650、rs12603332)与哮喘易感性相关。

根据以上研究基础，本实验立足于研究海南黎族居民中ORMDL3基因SNP表达情况。研究结果显示：黎族哮喘患者ORMDL3基因中rs7216389（TT型）和rs11650680（TT和CC）表达均与正常对照组有显著性差异。这结果与Leung等[10]以中国南方儿童为研究对象的结果相符，该结果表明，rs7216389和rs11650680可能与海南黎族居民哮喘相关，但其确切联系尚待进一步多中心研究加以证实。

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