甘蔗糖蜜发酵产黄原胶优良菌株的选育

何海燕

(河池学院化学与生命科学系，广西宜州546300)

甘蔗糖蜜发酵产黄原胶优良菌株的选育

何海燕

(河池学院化学与生命科学系，广西宜州546300)

黄原胶是由野油菜黄单胞菌发酵生产的重要的商业微生物多糖产品，实验通过微波诱变处理保藏菌株，筛选到一株能以甘蔗糖蜜为碳源发酵生产黄原胶的优良正突变株X12，实验结果表明:在初步确定的实验条件下，该菌株发酵生产黄原胶的产量达22.14 g/L，是未诱变菌株20183的1.53倍，传代实验表明，突变菌株X12的黄原胶产量及性状无大变化，遗传性状稳定。

甘蔗糖蜜;黄原胶;微波诱变

黄原胶又称为汉生胶，是一种用途广泛的微生物胞外多糖。它无味、无臭、无毒、食用安全，是目前国际上集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体，性能最优越的生物胶［1］，在石油工业、食品工业、医药、化工等诸多行业获得了广泛的应用［2］。目前，国内黄原胶发酵水平与国外先进水平相比尚有较大差距［3］，利用何种有效的途径提高黄原胶的产量与多糖的品质，节约生产成本，成为近年来黄原胶研究的主要方向［4］。

甘蔗糖蜜是糖厂的主要副产品，成分非常复杂并且其含糖量仍非常高，蔗糖和还原糖占30%～50%，是发酵、食品、饲料和建材工业中质优价廉的原料［5］，中国是甘蔗种植大国，甘蔗糖蜜原料非常充足，用糖蜜原料发酵生产黄原胶，可降低成本，节约能源，具有一定的经济及社会效益，实验通过微波对黄原胶生产菌进行诱变育种，以期得到能利用甘蔗糖蜜高效发酵生产黄原胶的优良生产菌种。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)20183，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。

1.1.2 仪器

YP202N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，SW－CL－2FD洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，GNP－9160BS－Ⅲ隔水式恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)，CS101－AB型电热鼓风干燥箱(中华人民共和国重庆试验设备制造)，K021B－BF美的微波炉(广东美的微波炉制造有限公司)，TXQ－LS－SⅡ全自动立式电热压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，糖用锤度计(浙江余桃仪表二厂)。

1.1.3 培养基

糖蜜由广西宜州石别糖厂提供，使用前按文献［6］处理得糖蜜酸化水解液备用;其余试剂均为分析纯试剂。

菌种活化培养基:蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L，pH值为7.0。

菌种培养液:蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 L，pH值为7.0。

平板培养基:蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，8°Bx糖蜜水解液1 L，pH值为7.0。

种子培养液:蛋白胨8 g，磷酸二氢钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，8°Bx糖蜜酸化水解液1 L，pH值为7.0。

摇瓶发酵培养基:蛋白胨5 g，磷酸二氢钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，柠檬酸1 g，10°Bx糖蜜酸化水解液1 L，pH值为7.0。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化

将保藏菌种转接至活化培养基中，28℃恒温培养36 h，使菌种活化，用于下一步实验。

1.2.2 微波诱变实验

(1)活化菌株生长曲线的测定。

取斜面活化菌株一环至菌种培养液中，28℃、180 r/min摇床培养，从6 h后开始，每隔3 h取样600 nm测其吸光度(A)值，以培养时间为横坐标、吸光度(A)值为纵坐标绘菌株生长曲线，根据生长曲线选择处于对数生长期的细胞进行诱变实验。

(2)微波诱变致死率曲线。

取10 mL处于对数生长期的菌种接入装有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，并用玻璃珠振荡，打散菌落。使用十倍稀释法稀释菌悬液，用血细胞计数法计数，选取约108个孢子/mL孢子菌悬液，分装5 mL至无菌离心管中，以900 W功率微波炉进行辐射处理，每次照射10 s后使平皿冷却，消除热效应，再进行照射，并将照射时间累计［7］。按照常规方法稀释浓度梯度涂布筛选平板，根据菌落数计算致死率并绘画致死曲线。

(3)黄原胶菌株诱变突变株筛选。

根据致死率曲线，以致死率为70%～80%的诱变剂量处理菌株［8］，经过辐射后涂布平板，在28℃下培养3 d，从平板上挑取大而圆的菌落接到摇瓶种子培养基内，置180 r/min摇床28℃恒温培养36 h，然后以10%接种量，装液量200 mL/500 mL三角瓶，28℃恒温摇床180 r/min培养72 h进行摇瓶复筛。

(4)遗传稳定性实验。

将选育出的产胶量最高的菌株接种于活化培养基上传代，共传六代，相同条件下发酵培养，测黄原胶产胶量，检测诱变所得黄原胶菌株的遗传稳定性。

1.2.3 黄原胶提取方法［9］

将95%乙醇和发酵液按1∶2比例混合，室温下搅拌20 min，过滤，得到黄原胶沉淀置于烘箱中，60℃烘干至恒重称量。

2 结果与分析

2.1 实验菌株生长曲线

菌种接种到均匀的液体培养基后，细菌以二分裂繁殖。经过迟缓期进入对数生长期，并以最大的速率生长和分裂，导致细菌数量呈对数增加，此时细菌生长呈平衡生长，即细胞内各成分按比例有规律地增加，所有细胞组分呈彼此相对稳定速度合成。对数生长期细菌的代谢活性高而稳定，细胞大小比较一致，生活力强，易变异，重复性较好。由图1可知，该菌株对数生长曲线为9～21 h，24 h后进入稳定期，所以选择培养18 h的菌液进行诱变处理。

图1 菌株20183的生长曲线

2.2 微波诱变实验

2.2.1 微波诱变致死率曲线

微波诱变是一种新兴的物理诱变育种技术，且设备相对简单，易于操作，安全高效。微波辐射会产生热效应，引起生物迅速升温并导致各种生物功能产生变化。随着微波时间的延长，致死率逐渐增大。由图2可知，当辐射时间为60 s时，致死率在70%～80%之间。根据诱变的机制，菌株的正突变几率可能性最大，因此选用60 s作为诱变筛选的辐射时间。

图2 微波诱变致死率曲线

2.2.2 黄原胶菌株诱变突变株筛选

以单位体积发酵液黄原胶的产量为筛选指标，筛选到1株黄原胶产量有较大提高的正突变株X12，由表1可知，该菌株黄原胶的产量达到了22.14 g/L，是未诱变菌株的1.53倍。

表1 微波诱变后菌株的黄原胶产量对比

2.2.3 遗传稳定性实验

为检验突变菌株X12发酵产胶的稳定性，实验将突变菌株连续传代6次，每代按初步确定的发酵条件测定其黄原胶产量。实验结果见表2，实验结果表明，突变菌株经过微波辐射诱变后，基因发生了突变，总产量得到提高且产量基本维持在22.14 g/L左右，有较好的遗传稳定性。

表2 突变菌株X12传代实验结果

3 结论

甘蔗糖蜜来源广，价格低，是重要的工业发酵原料，实验通过微波诱变处理保藏野油菜黄单胞菌20183，筛选到一株能以甘蔗糖蜜作为发酵原料生产黄原胶的优良正突变株X12，该菌株的黄原胶产量达22.14 g/L，是未诱变菌株的1.53倍，传代实验表明，该菌株遗产性状稳定。

［1］常春，马晓建，方书起，等.黄原胶补料分批发酵工艺的试验研究［J］.食品科学，2005，26(12):261－265.

［2］李卫旗，吴雪昌，姚恕.培养基的组成对黄原胶发酵产量与质量的影响研究［J］.工业微生物，1996，26(1):17－19.

［3］姚仕义，王金生.黄原胶生产菌株XCCNAU－92的选育［J］.生物技术，1998，(3):34－37.

［4］杨春玉，王霞，苏海军，等.黄原胶生物合成的研究进展［J］.现代化工，2005，25(2):24－28.

［5］保国裕.1998甘蔗糖综合利用及废液治理技术动态［J］.广西蔗糖，1999，14(1):38－44.

［6］张克旭.氨基酸发酵工艺学［M］.北京:中国轻工业出版社，1992.

［7］周建琴，高荣梅.康乐霉素C产生菌的微波诱变［J］.生物学杂志，2002，19(14):12－13.

［8］刘冬，张学仁.发酵工程［M］.北京:高等教育出版社，2007.

［9］里景伟.黄原胶的生产与应用［M］.北京:轻工业出版社，1995.

［责任编辑刘景平］

The Selection of High Yield Xanthan Gum Producing Strain by Using Sugar－cane Molasses Fermentation

HE Hai－yan
(Departerment of Chem istry and Life Science，Hechi University，Yizhou，Guangxi546300，China)

Xanthan gum is a commercially important polysaccharide produced by fermentation of Xanthomonas campestris．In this study，preservation of strainswas treated by usingmicrowave irradiation，and then a high yield Xanthan gum producing bacterium X12 that can use sugar－canemolasses as fermentation carbon source was selected．The experimental results show that under the experimental condition of the initial establishment，and that the yield of Xanthan gum is 22．14 g/L，153%higher than the original strain 20183．

sugar－canemolasses;Xanthan gum;microwavemutation

book=0,ebook=67

Q939.97

A

1672－9021(2012)02－0022－04

何海燕(1972－)，女，广西钟山人，河池学院化学与生命科学系副教授，主要研究方向:微生物发酵研究。

2011－12－05