丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶31(STK31)基因在小鼠脊髓损伤后的差异表达*

程结南,李 平,程 跃,章文信,蔡亚非

(安徽师范大学生命科学学院,芜湖 241000)

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,STK)是细胞中广泛存在的一种化学酶,其家族包括很多成员,主要是通过特异地催化蛋白质的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化来参与细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动。小鼠STK31基因位于第6号染色体上,其编码产物含有1018个氨基酸。目前已发现STK31与癌症及精子发生相关,而与脊髓损伤的关系还未见报道。本文旨在结合我们实验室前期工作并通过分子手段来确定STK31与脊髓损伤的潜在关联,为脊髓损伤研究提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 实验动物为本实验室繁殖的7～8周龄成年昆明小白鼠。随机挑选50只健康小白鼠,分为空白对照组和脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)处理组,其中空白对照组(A组)为假损伤组,只切开椎板不进行损伤处理即缝合;SCI处理组被设置为5个小组(n=5):B(损伤后4 h)、C(损伤后8 h)、D(损伤后1 d)、E(损伤后3 d)、F(损伤后7 d)。

1.1.2 仪器及试剂 Ultrospec 4300紫外分光光度计为瑞士安法玛西亚公司产品;ABI 7300 PCR扩增仪为美国应用生物系统(ABI)公司产品;RNA的提取及逆转录试剂购自上海生工;DNA扩增试剂及标准品购自广州市达晖生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 制作脊髓损伤模型 使用Nystrom法构建脊髓损伤模型。腹腔注射5%的水合氯醛麻醉小鼠,使其俯卧在实验手术台上并固定,沿着T8中线切开背部皮肤及附着组织,除去锥板,小心暴露脊髓,并用重物压迫脊髓,以下肢剧烈收缩作为其有效性的依据,压迫面积0.1 cm×3 cm,压迫5min,使小鼠脊髓中度受伤,然后移去重物,用生理盐水冲洗伤口后进行缝合;对照组只切开锥板不对脊髓进行损伤处理。每天3次对截瘫动物的膀胱区进行人工按压排尿,并防止并发症。观察记录各组小鼠双下肢的肌张力、反射及其大小便等一般情况。

1.2.2 取材 在各个时间点分别取SCI实验组及对照组小鼠各5只,在冰上处死,迅速取出损伤后的脊髓组织(脊髓损伤段上下约1 cm)及适量肺、脾、胸腺、肾、胃、心脏、大脑组织放入液氮罐中保存以备后绪实验用。

1.2.3 RNA提取 使用Trizol法来提取总RNA。取适量冻存的实验材料,加液氮研成粉末,迅速转移至装有3 ml预冷提取液的10 ml离心管中,混匀,依次加入0.3mlNaAc(2 mol/L,pH 4.0)、3 ml水饱和苯酚和 0.6ml氯仿-异戊醇(24∶1)充分混匀,冰浴15 min,4℃13 000 r/min离心30 min,将上层水相转移至1.5 ml离心管中,加入等体积的预冷异丙醇,混匀,置于-20℃2 h。4℃13 000 r/min离心30 min,去上清,将沉淀用75%的乙醇洗2次,稍晾干,将沉淀溶于100 μ l DEPC处理过的超纯水中,4℃16 000 r/min离心30 min。使用分光光度计检测RNA的浓度和纯度,并用1%甲醛变性琼脂糖电泳来检测其完整性,-70℃冰箱保存备用。

1.2.4 cDNA的合成 根据M-MLV反转录试剂盒说明合成cDNA,70℃水浴10 min后储存于-20℃冰箱备用。

1.2.5 半定量 RT-PCR 用Oligo v6.0来设计STK31基因的引物,其登录号、序列及退火温度见表1。在实验中实施双管法,以β-actin基因作为内标,β-actin基因引物为:上游引物(5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′);下游引物(5′-CCACAGGA TTCCATACCCAA-3′)。以cDNA为模板在相同的反应条件下扩增STK31和β-actin基因片段,PCR反应混合体系为:2.5 μ l10 ×PCR 缓 冲液(包含 Mg2+)、2 μ g 的 cDNA、0.5 μ l 10 mmol/L的dNTPs、1U的DNA聚合酶、上游引物及下游引物各2 μ l,加无菌水补至 25 μ l。 PCR 反应程序为:94℃ 5 min,94℃45 s、57.4℃ 30 s和 72℃ 60 s共 30个循环。PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶电泳上检测,拍照,通过Bandscan 5.0软件分析各胶带总灰度面积及灰度值,并得出STK31基因的相对表达量。

1.3 数据分析

2 结果

2.1 STK31基因在小鼠各组织中的表达特异性

通过半定量RT-PCR,结果显示STK31基因在小鼠的肾、胃、胸腺、脊髓、肺、脾、心脏、大脑等多个器官组织中都有表达,且在脊髓中表达明显(图1)。

Fig.1 Expression of STK31 gene in various tissues

2.2 脊髓损伤后不同时间STK31基因的差异表达

半定量RT-PCR扩增STK31和β-actin基因所得到的产物和预期的一样(图2),在各实验组中STK31基因都普遍表达。用Bandscan软件计算两基因的相对表达量,并经SPASS 13.0软件进行数据统计分析,结果显示STK31基因的表达量在损伤后4 h和1 d两组显著低于对照组(P＜0.01),而且在4 h、8 h、1 d、3 d呈现降低-回升-降低-回升的趋势(图 3)。

3 讨论

脊髓损伤不仅会导致神经组织出现即刻损伤,如:局部机械性损伤、缺血、细胞坏死等,往往还会引发更为复杂的继发性损伤,而炎症是脊髓损伤特别是继发性损伤过程中重要的病理反应。目前对脊髓损伤修复的分子机制研究大多集中于炎症调节相关基因,细胞凋亡相关基因及神经修复维护相关基因上,其中就包含细胞中广泛存在的丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员。

Fig.2 Electrophoresis photo of semi-quantitative RT-PCR of STK31 and β-actin gene

STK31是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中的一员,结构保守,包括三个结构域:tudor结构域、SbcC结构域和丝氨酸/苏氨酸激酶结构域,其中tudor结构域在一些RNA结合蛋白中频繁出现,或具有RNA结合功能,并已发现在果蝇发育中起重要作用,SbcC结构域具ATP酶功能可能参与DNA修复,激酶结构域位于蛋白质C端,包含丝氨酸/苏氨酸激酶家族所有预期保守氨基酸序列[1]。已发现STK31在人,马科动物、啮齿动物的睾丸组织和动物胚胎脑组织中特异表达[1];此外STK31还在多种肿瘤组织中高度表达,具有促进肿瘤发生的作用[2]。然而,STK31与脊髓损伤的相关性研究至今仍未见报道。本实验通过 R T-PCR技术检测到STK31可在小鼠肾脏、胃、脊髓、脑、心脏等多种器官中表达,且在脊髓中表达明显(图1)。在小鼠脊髓损伤后STK31出现两次显著的下调表达(P＜0.01,图 3),由此推断 STK31基因可能参与小鼠SCI后的信号调控。目前对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员的研究表明其作用范围广泛,包括中枢神经系统的调节与维护,细胞自我吞噬调节,免疫反应调节,钙离子调节,细胞凋亡调节等。范睿[3]等发现脊髓损伤后4 h开始出现大量神经元和胶质细胞凋亡,其中促凋亡因子表达上升,抑凋亡因子表达下降。Sakurai[4]等认为丝氨酸/苏氨酸激酶在脊髓损伤早期能延缓神经细胞的凋亡。本文结果显示SCI后4 h、8 h、1 d、3 d时STK31表达呈现降低-回升-降低-回升的趋势,而STK31的下调表达可能会加速神经细胞凋亡。此外丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶涉及免疫反应,而其表达量的恢复可能与相继的免疫反应强化有关,这还需进一步验证。STK31与另一种丝氨酸/苏氨酸激酶Camk4(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶)功能类似,暗示结构保守的STK31可能通过钙调节作用来参与细胞应答,而钙离子在脑和脊髓损伤特别是之后的继发性损伤中发挥着重要的作用[5]。

[1]Sabeur K,Ball BA,Corbin C J,et al.Characterization of a novel,testis-specific equine serine/threonine kinase[J].Mol Reprod Dev,2008,75(5):867-873.

[2]Yokoe T,Tanaka F,Mimori K,et al.Efficient identification of a novel cancer/testis antigen for immunotherapy using three-step microarray analysis[J].Cancer Res,2008,68(4):1074-1082.

[3]范 睿,鲁亚平,蔡亚非,等.小鼠脊髓挫伤型损伤后caspase-3、bax、bcl-2和 c-kit基因的表达[J].南京农业大学学报,2010,33(1):87-89.

[4]Sakurai M,Hayashi T,Abe K,et al.Induction of phosphatidylinositol 3-kinase and serine-threonine kinase-like immunoreactivity in rabbit spinal cord after transient ischemia[J].Neurosci Lett,2001,302(1):17-20.

[5]Wu J Y,Ribar T J,Cummings D E,et al.Spermiogenesis and exchange of basic nuclear proteins are impaired in male germ cells lacking Camk4[J].Nat Genet,25(4):448-452.