尖孢镰刀菌 Cu02对黄瓜的致病性及防治根结线虫的效果

王刚李二峰茆振川杨宇红谢丙炎

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部蔬菜遗传改良重点开放实验室，北京 100081）

南方根结线虫（Meloidogyne incognita）发生普遍，尤其在设施栽培中发病更为严重。每年对各种农作物造成的损失达到几十亿美元（Barker & Koenning，1998）。根结线虫侵染后，在黄瓜（Cucumis sativusL.）根部形成根结，根部吸收功能被破坏，造成地上部矮小、黄化甚至叶片脱落。镰刀菌（FusariuMspp.）普遍存在于土壤中，世界各地广泛分布，分为致病菌和非致病菌。在土壤中，大量的菌株是非致病的，在土壤中起着未知作用。镰刀菌和根结线虫都是植物的重要病原物，这两种病原物之间在寄主植物中存在着非常复杂的互作关系。植物寄生性线虫通常能够促进植物病原菌的侵染及扩展，从而引起严重的病害（Mai & Abawi，1987）。在田间已经报道根结线虫的侵染可以加重番茄、甘蓝、棉花、烟草枯萎病的发生（Mai & Abawi，1987）。然而，一些非致病性的菌株被认为是内寄生性的共生菌，它们能在许多植物的根组织中定殖，但是并不引起病害，而且能够增加植物对真菌病害及植物寄生线虫的抗性（Olivain &Alabouvette，1997；Diedhiou et al.，2003；Vu et al.，2006）。

由于栽培黄瓜中未发现抗南方根结线虫的种质资源，在生产中化学防治仍然是防治根结线虫的重要措施，如灭线磷、溴化钾和百亩威等（梁建根和郑经武，2010）。这些药剂虽然杀虫快，但是会严重降低蔬菜质量，污染环境，破坏生态平衡，因此生物防治措施日益受到人们的关注。国外已经利用节丛孢菌（Arthrobotrysspp.）开发成商品菌剂 Royale350，利用巴斯德杆菌（Pasteuria）防治南方根结线虫的研究也有报道（Siddiqui et al.，2001）。这些捕食性真菌和寄生性细菌在土壤中可以有效地防治线虫，但是捕食性真菌对于线虫的捕食是非选择性的，而巴斯德杆菌为专性寄生等特性都限制其高效发展（范圣长 等，2004）。所以人们开始寻求能够定殖于植物内的真菌来防治线虫。

尖孢镰刀菌Cu02能够定殖于植物体内，是一种非致病的尖孢镰刀菌，张小艳等（2007）报道了镰刀菌是根结线虫拮抗真菌的优势种群。目前还没出现抗线虫的黄瓜品种。尖孢镰刀菌能定殖于黄瓜体内，所以在其与其他土壤真菌竞争的过程中，就有了很大的优势，在防治线虫的作用上，就有了“守株待兔”的效果。总之，用这样一种对线虫有拮抗作用、对黄瓜非致病的、定殖于植株体内的的真菌来防治根结线虫，会稳定的发挥防效，而且对植物没有影响。所以本试验对尖孢镰刀菌Cu02对黄瓜的致病性以及防治南方根结线虫的效果进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

供试黄瓜品种 9330由中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组提供。尖孢镰刀菌 Cu02菌株为黄瓜内分离到的内生菌，由本所病害实验室提供；南方根结线虫采自市北京市海淀区四季青农场，并在温室中进行单卵块繁殖，收集卵块孵化的2龄幼虫，于2011年5月6日用于接种试验。

1.2 尖孢镰刀菌Cu02在黄瓜上的定殖

1.2.1 尖孢镰刀菌接种方法 将黄瓜（9330）种子用5%的NaClO消毒10 min，用无菌水清洗干净后29 ℃催芽1 d，播种于苗盘中，以灭菌土为介质在25～28 ℃温室中萌发、培养。当黄瓜两片子叶完全展开时将幼苗根部土壤轻轻洗掉，用于接种试验。镰刀菌接种采用浸根法，将幼苗根部在浓度为2.8×106个·mL-1的孢子悬浮液中浸泡15 min，然后定植于苗钵（规格:10 cm×10 cm×15 cm）中，以灭菌土为基质在25～28 ℃温室中培养，接种7 d时检测尖孢镰刀菌Cu02的侵染情况，在21 d时检测尖孢镰刀菌Cu02对黄瓜9330的致病性。每处理接种20株幼苗，3次重复，并以清水模拟接种为对照。

1.2.2 Cu02定殖检测 接种7 d时，将黄瓜幼苗根部土壤轻轻冲洗掉，除去须根和叶片只保留茎秆，用70%乙醇处理30 s，然后用0.5%的NaClO 处理3 min，用无菌水冲洗3次，将茎秆切成0.5 cm的小段，在含有链霉素（150 mg·L-1）的PDA培养基上分离接种的尖孢镰刀菌Cu02，于28 ℃避光培养，3 d后观察内生真菌的分离情况。调查尖孢镰刀菌Cu02在接种黄瓜幼苗上的侵染、定殖情况。并在接种尖孢镰刀菌Cu02菌株7、21 d时，分别观察植株的症状，调查黄瓜生长情况。

若有菌落长出，挑取菌丝，在显微镜下观察菌丝及孢子特征。挑取单胞，在新的PDA平板上28 ℃培养5 d，用刀片刮取菌丝，采用改良CTAB法提取基因组DNA（曹宜 等，2004），以引物 EF-F:5’-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3’和 EF-R:5’-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3’对分离菌进行分子鉴定（Mbofung et al.，2007）。PCR扩增程序:95 ℃ 4 min，1个循环；95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 50 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。将DNA片段进行切胶回收（Transgene），连接到pGEM-T载体，转化到Trans5α感受态细胞，在含有 IPTG（40 mg·L-1）、X-GAL（20 mg·L-1）及 AMP（100 mg·L-1）的 LB 培养基上进行蓝白斑筛选。37 ℃ 16 h后挑取白色菌落经PCR检测呈阳性的克隆进行测序（三博远志公司）。将获得的核苷酸序列在 NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行对比，在分子水平上鉴定菌株的种类。

1.3 Cu02对黄瓜根结线虫的防治效果

1.3.1 接种南方根结线虫 挑取成熟的南方根结线虫卵块，用0.1%的NaClO消毒5 min，无菌水清洗3次，置于28 ℃下孵化，24 h后收集2龄幼虫（J2）用于接种试验。在接种尖孢镰刀菌Cu02 7 d后，接种南方根结线虫。接种时在距离黄瓜根2 cm处的基质中均匀打3个1 cm深的小孔，注入南方根结线虫悬浮液，每株接种南方根结线虫400条，每个处理接种20株，3次重复，并且以清水模拟接种为对照。接种后的幼苗在温室中进行正常管理。

1.3.2 防效检测 在黄瓜接种南方根结线虫21 d后，将黄瓜幼苗根部土壤轻轻洗净冲洗掉，观察根部症状，检测根结，统计大根结和小根结数量，并用 SAS软件（9.1）anova程序对结果进行方差分析。同时通过根结减退率计算Cu02对南方根结线虫的防治效果。

1.3.3 根结内镰刀菌分离检测 在接种和未接种尖孢镰刀菌 Cu02的黄瓜植株中，随机挑取 10株，每株分别随机切下20个根结，用1%的NaClO消毒10 min后，在含有链霉素（150 mg·L-1）的PDA培养基上分离尖孢镰刀菌Cu02，每个培养皿放置来自同一植株的20个根结，于28 ℃避光培养，3 d后观察根结内镰刀菌的分离情况。菌落的显微观察及分子鉴定方法同1.2。

2 结果与分析

2.1 菌体寄生定殖检测

2.1.1 Cu02在黄瓜植株内的定殖检测 经过表面消毒的茎段在PDA培养基上培养3 d后，被检测的30株植株每株根部和茎基部茎段都有白色的菌丝长出，形成菌落。培养7 d时植株的绝大部分茎段都有白色的菌丝长出，茎段中出现菌落的概率达到 91.0%，只有少数顶部茎段没有分离到菌丝（图 1-B），而对照中的所有茎段都没有分离到白色的菌丝（图 1-A）。说明尖孢镰刀菌Cu02可以成功的在黄瓜植株内定殖，而且在根部和茎基部的定殖率最高，达到100%。

2.1.2 Cu02在根结内的定殖检测 在PDA培养基上，每株接种Cu02的黄瓜植株上都有一些根结能分离到尖孢镰刀菌Cu20，并生长形成菌落（图2-B）。但并不是每个根结都能分离出菌落。对分离到镰刀菌的根结数量进行统计分析，发现Cu02在根结内的定殖率只有11.9%。而未接种Cu02的对照黄瓜植株上的根结中未分离到任何真菌（图2-A）。

2.1.3 菌体形态及分子检测 在茎段和根结上分离到的尖孢镰刀菌，培养3 d时菌丝均匀的覆盖茎段或根结表面，菌落菌呈现为白色的绒毛状；培养 7 d时菌丝进一步生长，密度加大，在根结上的菌落呈现为以根为中心圆形，菌丝成茸毡状，菌落的颜色也变为淡粉红色。在显微镜下观察发现有隔菌丝，孢子有小型分生孢子和大型分生孢子（图3）。小型分生孢子多数为单细胞，偶有一个隔膜，长椭圆形或短杆状，无色；大型分生孢子呈镰刀形，少许弯曲，以 3个隔膜为主，具有尖孢镰刀菌的典型形态特征。两种分离菌的形态特征与Cu02菌株完全一致。

图1 黄瓜接种Cu02 7 d时组织分离菌株生长情况

图2 尖孢镰刀菌Cu02在根结内的定殖检测结果

图3 菌体的显微检测结果

将在茎段及根结上分离到的菌株进行单胞培养，以提取的基因组DNA为模板，用EF引物扩增，在两种分离菌落中都得到了大小相等的片段（图4），采用DNAMAN（5.0）软件比较测序结果，显示两片段均为710 bp，且序列相同。在 NCBI数据库进行 BLAST，与FusariuMoxysporum的转录延长因子片段一致性达到 100%，排除期望值为 0，与 Cu02菌株的转录延长因子片段的核苷酸序列完全一致。

结合形态学与分子鉴定结果分析证实，从茎段及根结中分离到的菌株均为接种的尖孢镰刀菌Cu02，也进一步证明Cu02菌株可以在黄瓜9930植株内定殖。

图4 EF引物扩增条带

2.2 防治南方根结线虫效果

接种Cu02菌株7、21 d时，对照与处理均未发现发病植株，植株生长健壮，长势良好无病症（图5）。在接种南方根结线虫28 d后，调查根结情况，发现Cu02处理与对照的黄瓜幼苗在根结大小（图6）、数量（图7）上存在差异。在Cu02处理的植株上，小根结数量平均为68.8个·株-1，大根结（Ф＞2 mm）数量平均为3.5个·株-1；而在对照中，小根结平均为101.9个·株-1，大根结为14.8个·株-1（图8）。通过SAS软件anova程序对处理与对照中的小根结数进行分析，发现F=15.18，P=0.000 3，证实处理与对照中的小根结数量存在显著差异；而对其中的大根结的数量进行方差分析，得到F=56.92，P＜0.000 1，说明处理与对照植株上的大根结数量存在着极显著差异。按根结减退率公式计算得到，Cu02对黄瓜的根结减退率达到38.0%。这些结果表明非致病尖孢镰刀菌Cu02在黄瓜上对于南方根结线虫具有一定的防治效果。

图5 黄瓜接种尖孢镰刀菌Cu02后的症状

图6 Cu02处理后根结大小情况

图7 Cu02处理后南方根结线虫侵染症状

图8 Cu02处理与对照黄瓜的根结数量

3 讨论

通过本试验证明非致病尖孢镰刀菌Cu02可以成功的在黄瓜植株内定殖，在根部的定殖率可以达到100%，而且对黄瓜的生长没有任何影响，这就形成了Cu02防治根结线虫的独特优势。根结线虫侵染植物的根部，形成根结，为害作物。而非致病性尖孢镰刀菌可以较早的在植物的根部定殖，对根结线虫的侵染、寄生及根结发育产生一定影响，从而对植物形成保护作用。现在已经有很多关于非致病镰刀菌防治根结线虫的报道（Diedhiou et al.，2003）。在国内，已经证明了镰刀菌对根结线虫的毒杀特性，尖孢镰刀菌是根结线虫的拮抗菌，作为根结线虫生防菌具有巨大潜力（段玉玺 等，2010）。有关研究表明，镰刀菌可以产生某些代谢产物毒杀卵粒，再定殖于卵，影响其发育（刘国坤 等，2006）。相对于土壤中的尖孢镰刀菌，非致病性植物内寄生尖孢镰刀菌在防治根结线虫上具有独特的优势。首先，由于内定殖特性使得菌株受到外界其他微生物竞争作用较小，有利于稳定的发挥防效；其次，非致病性镰刀菌为丝状真菌，为采用生物技术改造提供了高效的技术平台试验载体，随着生物技术的发展将杀线虫的特异基因如蛋白酶基因等转入菌丝，在植物根部特异表达杀线虫基因，从而大大提高了防治植物寄生性线虫的效果。特别是在当前黄瓜还没有可利用的抗根结线虫品种条件下，更加具有重要的研究意义。

在黄瓜上，尖孢镰刀菌Cu02显示出对南方根结防治效果为38.0%，虽为显著，但还不理想。试验发现，Cu02在黄瓜植株根部的定殖率达到100.0%，然而在根结中的定殖率只有11.9%，这可能与Cu02对根结线虫的防治效果较低有直接的关系。所以提高Cu02的防治效果的关键就在于提高Cu02在黄瓜植株内的存在数量及存活能力。在接种条件、接种时间及接种的最佳孢子浓度上需要深入探索，从而进一步提高对根结线虫的防治效果。此外，可以尝试尖孢镰刀菌Cu02与化学药剂的联合使用，有利于制备出更高效的生防菌剂。

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