哈蟆油中免疫活性部位的提取工艺与药效学研究Δ

王微，郑飞，李霞，张炜煜（长春中医药大学，长春130117）

哈蟆油为中国林蛙（Rana temporaria chensinensisDavid）雌蛙的干燥输卵管，又称“林蛙油”。该药是2010年版《中国药典》收载品种，具有补肾益精、养阴润肺之功效；用于治疗阴虚体弱、神疲乏力、心悸失眠、盗汗不止、痨嗽咳血[1]。有研究表明，蛋白质被水解成小分子的肽类或游离氨基酸后，更易被人体快速和多途径吸收[2～4]。蛋白质可用酶法或酸法水解分离出，但酶法水解蛋白质较酸法水解作用温和且条件容易控制。因此笔者对哈蟆油中有效部位，即蛋白质采用酶法进行提取，并通过药效学实验验证其免疫调节作用，为哈蟆油的临床应用提供理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

JA5103N型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ2200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；pHS-25C型数字酸度剂（上海鹏顺科学仪器有限公司）；HHS21-Hi6电热恒温水浴锅（北京市长源实验设备厂）；DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；E53042432型移液器（日本Nichirtyo公司）；WFH-203J型三用紫外-可见分析仪（上海精科实业有限公司）。

1.2 试药

哈蟆油为中国林蛙（中国林蛙购自吉林省桦甸市苏密沟林场，经长春中医药大学姜大成教授鉴定为真品）雌蛙蛙体干燥后剥取的输卵管，真空30℃烘干后，粉碎机粉碎，过100目筛，－5℃冰柜贮藏；环磷酰胺（浙江海正药业股份有限公司，批号：20100103）；木瓜蛋白酶（北京鼎国生物技术有限责任公司，批号：98010420）；氢氧化钠、硫酸铜、盐酸、硫酸钾、硫酸、甲醛均为分析纯。

1.3 动物

ICR小鼠140只，♀♂兼半，体重（20±2）g，购自吉林大学白求恩医学院实验动物中心（动物生产合格证号：0003217）。

2 方法与结果

2.1 酶解液水解度和收率的测定

精密吸取酶解液5.0mL，置于锥形瓶中，加入20.0mL去二氧化碳蒸馏水，搅拌均匀，加入0.01mol·L－1NaOH标准溶液调节pH值至8.2，加入已中和好的甲醛溶液10mL，记录将其pH值调节至9.2时所耗0.01mol·L－1NaOH标准溶液的毫升数；以相同方法进行空白实验，记录毫升数。则水解液氨基氮为：水解液氨基氮（g·100g－1）＝（A－B）×N×V1×K×100/V（A：滴定水解液样品消耗NaOH标准溶液的体积(mL)；B：滴定空白样品消耗NaOH标准溶液的体积（mL）；N：滴定NaOH标准溶液的浓度（mol·L－1）；K：1mL 1mol·L－1NaOH标准溶液相当于氮的质量（g），K＝0.014；V：滴定水解液样品的体积（mL），在该试验中V＝5mL；V1：水解液的总体积（mL））。

水解度（%）＝水解液氨基氮/样品总氮量×100%

收率（%）＝提取物干重/生药材×100%

2.2 酶法水解哈蟆油中蛋白质的提取工艺优选

2.2.1 哈蟆油中蛋白质1次水解提取工艺优选 以单因素试验结果为基础，确定考察因素为提取时间（A）、提取温度（B）、木瓜蛋白酶量（C）和提取pH值（D）。采用L9（3）4正交试验表进行试验，以酶解液的水解度和收率为评价指标，通过综合评分（综合评分＝0.4×收率+0.6×水解度）确定最佳工艺。因素水平见表1；正交试验结果见表2；方差分析结果见表3。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交试验结果Tab 2Results of orthogonal experiment

表3 方差分析结果Tab 3 Results of analysis of variance

由表2、表3可知，通过综合评分，影响哈蟆油1次水解工艺因素的主次顺序为提取温度＞酶量＞提取时间＞提取pH值，提取温度对水解工艺有显著性影响（P＜0.05）。结合上述结果，从降低成本、提高效率考虑，哈蟆油（P＜0.05）1次水解的最佳工艺条件为A1B2C1D1，即加木瓜蛋白酶2000u·g－1，调节pH值至6.0，在45℃下提取4.5h。

2.2.2 哈蟆油中蛋白质2次水解提取工艺优选 以单因素试验结果为基础，确定考察因素为提取时间（A）、提取温度（B）、固液比（C，V/V）和提取pH值（D）。采用L9（3）4正交试验表进行试验，以酶解液的水解度和收率为评价指标，通过综合评分（计算同“2.2.1”项下方法）确定最佳工艺。因素水平见表4；正交试验结果见表5；方差分析结果见表6。

表4 因素水平Tab 4 Factors and levels

由表5、表6可知，通过综合评分，影响哈蟆油2次水解工艺的因素的主次顺序为固液比＞提取时间＞提取温度＞提取pH值，固液比对水解工艺有显著性影响（P＜0.05）。结合单因素试验和上述结果，从降低成本、提高效率考虑，哈蟆油2次水解的最佳工艺条件为A1B1C2D1，即固液比为1∶20（V/V），调pH值至6.0，在40℃下提取4.5h。

表5 正交试验结果Tab 5 Results of orthogonal experiment

表6 方差分析结果Tab 6Results of analysis of variance

2.3 验证试验

按1次水解最佳工艺条件提取3批哈蟆油中蛋白质，进行验证试验。结果，3批样品哈蟆油酶解液的平均收率为31.4%，RSD＝2.6%，平均水解度为30.85%，RSD＝1.8%；进一步按2次水解最佳工艺条件提取3批哈蟆油中蛋白质。结果，3批样品中哈蟆油酶解液收率为25.0%，RSD＝2.0%，平均水解度为34.58%，RSD＝1.9%；采用酶法水解提取哈蟆油中蛋白质，2次酶解所得哈蟆油酶解液收率为56.4%，水解度为65.43%。与正交试验结果最高值相当，表明该工艺稳定、可行。

2.4 哈蟆油提取物双向免疫调节作用的研究

2.4.1 复制模型[5，6]ip环磷酰胺30mg·kg－1，每天1次，连续5d，复制免疫低下小鼠模型；ip环磷酰胺 200mg·kg－1，每天1次，连续3d，复制免疫增强小鼠模型。

2.4.2 哈蟆油提取物对免疫低下模型小鼠免疫功能的影响

实验分为8组，即空白、模型、常温酶解（0.1g·kg－1）和蛤蟆油提取物①、②、③、④、⑤（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80g·kg－1）组。ig给药，每天1次，连续7d。分别以小鼠免疫器官的脏器指数、巨噬细胞吞噬系数为评价指标，验证哈蟆油提取物对免疫低下小鼠功能的影响。哈蟆油提取物对免疫低下模型小鼠免疫功能的影响见表7。

由表7可知，与空白组比较，模型组小鼠脾指数、胸腺指数显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，蛤蟆油提取物②、③、④、⑤组脾指数、胸腺指数显著升高（P＜0.01或P＜0.05）。与空白组比较，模型组吞噬指数显著性降低（P＜0.05）；与模型组比较，哈蟆油提取物②组吞噬指数显著升高（P＜0.01）。结果表明，哈蟆油0.1g·kg－1对免疫低下小鼠的免疫功能有明显的增强作用，并且对受损伤的免疫器官起到保护作用。

表7 哈蟆油提取物对免疫力低下模型小鼠免疫功能的影响（±s，n＝10）Tab 7 Effects of R.temporaria chensinensis extract on visceral index of low immunity model mic（e±s，n＝10）

表7 哈蟆油提取物对免疫力低下模型小鼠免疫功能的影响（±s，n＝10）Tab 7 Effects of R.temporaria chensinensis extract on visceral index of low immunity model mic（e±s，n＝10）

与空白组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

给药剂量/g·k g－1组别空白组模型组哈蟆油提取物①组哈蟆油提取物②组哈蟆油提取物③组哈蟆油提取物④组哈蟆油提取物⑤组常温酶解组- -吞噬指数0.028±0.0050.024±0.003＊0.016±0.0060.035±0.010##0.020±0.0060.018±0.0030.020±0.0030.016±0.0060.050.100.200.400.800.10脏器指数脾指数/g·k g－1 4.67±0.762.04±0.43＊＊2.50±0.732.75±0.80#2.83±0.90#2.72±0.66#2.64±0.61#2.81±0.84#胸腺指数/g·k g－1 3.81±0.500.80± 0.17＊＊1.00±0.251.25±0.38##1.26±0.45##1.48±0.50##1.34±0.62##1.16±0.75

2.4.3 哈蟆油提取物对免疫增强小鼠免疫功能的影响 实验分为6组，即空白、模型、常温酶解（0.1g·kg－1）和蛤蟆油提取物高、中、低剂量（0.4、0.2、0.1g·kg－1）组。ig给药，每天1次，连续7d。分别以小鼠免疫器官的脏器指数、巨噬细胞吞噬指数为评价指标，验证哈蟆油提取物对免疫增强模型小鼠免疫功能的影响。哈蟆油提取物对免疫增强模型小鼠免疫功能的影响见表8。

表8 哈蟆油提取物对免疫力增强模型小鼠免疫功能的影响（±s，n＝10）Tab 8Effect of R.temporaria chensinensis extract on phagocytic function of macrophage in high immunity model mice（±s，n＝10）

表8 哈蟆油提取物对免疫力增强模型小鼠免疫功能的影响（±s，n＝10）Tab 8Effect of R.temporaria chensinensis extract on phagocytic function of macrophage in high immunity model mice（±s，n＝10）

与空白组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

吞噬指数3.81±0.501.03±0.22＊＊1.33±0.44#1.46±0.47##1.42±0.42##1.26±0.30#给药剂量/g·k g－1组别空白组模型组哈蟆油提取物低剂量组哈蟆油提取物中剂量组哈蟆油提取物高剂量组常温酶解组- -0.100.200.400.10脏器指数脾指数/g·k g－1 4.67±0.761.17±0.18＊1.63±0.39#1.73±0.41#1.75±0.36#1.45±0.12#胸腺指数/g·k g－1 0.028±0.0050.034±0.010＊0.025±0.005#0.018±0.004##0.014±0.004##0.026±0.009

由表8可知，与空白组比较，模型组小鼠脾指数、胸腺指数显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，哈蟆油提取物高、中、低剂量组脾指数、胸腺指数显著升高（P＜0.01或P＜0.05）。与空白组比较，模型组吞噬指数显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，哈蟆油提取物高、中、低剂量组吞噬指数显著升高（P＜0.01或P＜0.05）。研究显示，哈蟆油0.1、0.2、0.4g·kg－1对免疫增强模型小鼠有显著的抑制作用，以用药少、疗效好为原则，综合“2.3.2”结果，最后设定0.2g·kg－1为有效剂量。

3 讨论

现代研究表明，哈蟆油含水、无机物、粗脂肪、蛋白质、多种激素等多种成分。胡鑫等[7]测定的哈蟆油粗蛋白含量达50%以上，故采用正交试验法对哈蟆油中蛋白质进行最佳提取工艺的研究，由于1次水解不够完全，所以采用2次水解。

单因素考察结果表明，固液比对哈蟆油水解度和收率的影响较大；随着固液比的增大，酶解液的水解度和收率逐渐增大。当固液比为1∶20（V/V），水解度和收率均达到最大值，分别为19.96%、24.93%。由于酶解液中含水量过多使干燥困难，故将哈蟆油水解的固液比水平确定在1∶18～1∶22范围内。

0.1g·kg－1哈蟆油提取物对免疫低下模型小鼠免疫功能有显著的增强作用。与模型组比较，哈蟆油提取物低剂量组能够升高吞噬系数，用以达到免疫调节的作用，脏器指数显著提高，对环磷酰胺造成的脏器萎缩起到保护的作用。

0.2g·kg－1哈蟆油提取物对免疫增强模型小鼠有显著的抑制作用。与模型组比较，哈蟆油提取物中剂量组吞噬系数显著升高，用以达到免疫调节的作用，脏器指数明显改善，对环磷酰胺造成的脏器萎缩起到保护的作用。

综上，所选提取方法合理、可行，提取的蛋白质有一定的免疫调节作用。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010版.北京：中国医药科技出版社，2010：49.

[2] 张根生，周 云，费英敏，等.鸡全蛋蛋白质酶水解工艺的研究[J].食品工业科技，2003，24（1）：55.

[3] 余俊梅，曲静然.促进骨钙生物可利用性的研究[J].食品科技，2002，2：60.

[4] 余 兰，于香安，李 芳.宽体金线蛭提取工艺研究[J].中国药房，2005，16（10）：734.

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[7] 胡 鑫，刘成柏，陈小平，等.林蛙油中主要营养保健成分含量的研究[J].吉林农业大学学报，2003，25（2）：218.