茜草双酯对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用研究

黄桥华 刘心强 邱倩

缺血-再灌注损伤已经成为威胁人类生命的一个病理生理改变而越来越受到研究者的关注。心肌细胞凋亡是缺血-再灌注损伤的重要表现形式，尤其在缺血-再灌注早期，心肌细胞凋亡作用更为明显。多年来，研究各种药物对缺血-再灌注损伤及心肌细胞凋亡的影响一直是科研热点，也是此领域急需解决的课题之一。因此寻找有效的药物来抑制细胞凋亡对防治心肌缺血-再灌注损伤具有重要意义。本研究通过建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型，使用茜草双酯的干预，探讨茜草双酯对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物为清洁级出生1～3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠的乳鼠，雌雄不限，由赣南医学院实验动物中心提供。

1.1.2 茜草双酯购自上海第二制药厂，DMEM培养基、胰蛋白酶、5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)购自Sigma公司，胎牛血清(南美产)购自Hyclone公司，乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒、丙二醇(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，细胞凋亡和坏死检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌细胞培养 出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠，消毒后取心脏，剪碎后用0.08%的胰蛋白酶消化液消化，用含15%胎牛血清的高糖DMEM终止消化，离心后重悬细胞，吹打均匀后经200目细胞筛滤去细胞团和未消化的组织块，细胞计数后调整细胞浓度约5×105个/ml，接种至培养瓶中，差速贴壁法分离心肌细胞，加入0.1 mmol/L的BrdU纯化心肌细胞，放入37℃CO2培养箱中培养24 h更换培养基，之后根据细胞生长情况1～2 d更换培养基。

1.2.2 心肌细胞缺氧/复氧模型建立 参照文献［1］方法，根据实验室装置建立缺氧复氧模型:在原代心肌细胞中换入无血清高糖DMEM培养基孵育12 h。快速换入经95%N2～5%CO2混合气平衡的低糖无血清DMEM培养基，并迅速移入该种混合气充分平衡的单向气流缺氧装置中，持续通入95%N2～5%CO2混合气。细胞缺氧4 h后迅速换入无血清高糖DMEM培养基，并放入95%O2～5%CO2培养箱中孵育。使心肌细胞遭受缺氧/复氧损伤。

1.2.3 实验分组 原代心肌细胞培养3～4 d后，细胞生长融合且同步搏动良好时分为:①正常对照组;②缺氧/复氧模型预先加茜草组;③缺氧/复氧模型组。

1.2.4 细胞上清LDH、MDA测定 收集各组细胞上清，用LDH、MDA试剂盒检测上清的上述反应细胞损伤程度的指标。

1.2.5 细胞凋亡与坏死检测 使用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双染的方法检测，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学方法 使用SPSS 14.0 for Windows软件进行统计分析，定量资料以均数±标准差(±s)表示，选择重复测量的方差分析过程，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞上清LDH、MDA测定结果比较 三组比较发现，正常对照组LDH活性和MDA含量最低，缺氧/复氧模型预先加茜草组和缺氧/复氧模型组LDH活性和MDA含量明显升高(P＜0.01);缺氧/复氧模型预先加茜草组和缺氧/复氧模型组比较发现，缺氧/复氧模型预先加茜草组较缺氧/复氧模型组LDH活性和MDA含量降低有统计学意义(P＜0.05)(见表1)。

表1 各组细胞上清LDH活性和MDA含量比较(±s)

表1 各组细胞上清LDH活性和MDA含量比较(±s)

注:与正常对照组比较，(1)P＜0.01;与缺氧/复氧模型组比较，(2)P＜0.05

LDH活性(U/L) MDA含量(nmol/L)17.96±2.01 1.07±0.29缺氧/复氧模型预先加茜草组 62.59±6.09(1)(2) 1.77±0.34(1)(2)缺氧/复氧模型组 116.15±5.77(1) 2.29±0.27(1)正常对照组

2.2 细胞凋亡与坏死检测结果 在荧光显微镜下观察发现，正常对照组中细胞凋亡和坏死不明显，而缺氧/复氧模型预先加茜草组和缺氧/复氧模型组有不同程度的细胞凋亡和坏死。与缺氧/复氧模型组比较，缺氧/复氧模型预先加茜草组细胞凋亡和坏死有所减少(见图1～3)。

图2 缺氧/复氧模型预先加茜草双酯组

图1 正常对照组

图3 缺氧/复氧模型组

3 讨论

缺血-再灌注损伤是心肌组织坏死的常见原因，而细胞凋亡是其发病机制中的重要环节之一［1］。缺血-再灌注损伤的机制尚未完全阐明，目前认为I/R损伤的基础是细胞能量代谢障碍。心脏是一个高耗能的器官，维持其正常的生理功能需要大量的能量供应，而心肌能量代谢障碍是缺血-再灌注损伤的始动环节［2］。并认为其可能与缺氧/复氧后自由基释放增加、钙离子超载及线粒体损伤等变化有密切关系［3-6］。茜草双酯是人工合成的萘酚化合物［6］，茜草双酯在临床上常用于升高白细胞作用［7，8］。目前有研究表明，茜草双酯对缺血心肌有抗氧化作用［9］。本实验通过建立缺氧复氧心肌细胞模型，给予茜草双酯预处理，分别测各组细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量及细胞的凋亡与坏死，发现茜草双酯对体外培养的缺氧/复氧心肌细胞具有保护和抗凋亡作用。

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