HPLC法同时测定乳酸菌饮料中2种防腐剂和3种甜味剂

王京京

(北京市昌平区产品质量监督检验所，北京 102200)

高效液相色谱(HPLC)法是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分析分离技术，它是在经典液相色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，采用高压输送流动相和高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法，具有分离度高、选择性好、分析速度快、检测灵敏度高、操作自动化程度高和应用范围广等特点[1]。

苯甲酸、山梨酸是食品行业中常用的食品防腐添加剂，乙酰磺氨酸钾(安赛蜜)、天门冬酰苯丙氨酸甲酯(阿斯巴甜)、糖精钠则是食品中常用的甜味剂。在目前所使用的添加剂中，绝大多数为化学合成添加剂，它们是通过氧化、还原、缩合等一系列化学合成反应所得，有的具有一定的毒性，有的在食品中起变态反应或转化成其它有毒物[2]。我国标准GB 2760–2011中明确规定了乳酸菌饮料中各种添加剂的使用种类和限量标准[3]。因此建立一种快速、准确、同时检测多种防腐剂和甜味剂的方法对于食品行业的监管意义重大。

高效液相色谱法是目前甜味剂和防腐剂定量分析的首选方法[4–7]，但国家标准方法对3种以上甜味剂与防腐剂同时检测的标准较少，且乳饮料一般含鲜乳成分或乳粉和一些增稠剂，给样品前处理工作带来了较大的难度。笔者对样品前处理及上机测定条件进行了深入研究，成功地建立了快速测定乳酸菌饮料中2种防腐剂和3种甜味剂的高效液相色谱法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1200型，配有紫外可见光检测器和Rev.06色谱工作站，美国安捷伦公司；

超声振荡器：KQ2200DE型，昆山市超声仪器有限公司；

高速离心机：SIGMA 3K30型，德国Sigma公司；

电子天平：AE系列，梅特勒–托利多仪器(上海)有限公司；

甲醇：色谱纯，美国FISHER公司；

乙酸铵、硫酸铵、乙酸锌、氢氧化钠、亚铁氰化钾、无水乙醇：分析纯，北京化学试剂厂；

标准储备液：乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸浓度均为1.0 mg／mL(国家标准物质研究中心)，糖精钠浓度为1.0 mg／mL(北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司)；

天门冬酰苯丙氨酸甲酯标准物质：纯度不小于99%，中国计量科学研究院；

实验用水：电导率为0.0768 μS／cm的去离子水。

1.2 色谱条件

色谱柱：XDB–C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；紫外检测波长为230 nm，从13 min开始将紫外检测波长切换至205 nm；柱温：35℃；流动相为甲醇和0.02 mol／L乙酸铵溶液组成，流速为1.0 mL／min。

梯度洗脱程序：0～14 min，甲醇体积分数为5%；14～18 min，甲醇的体积分数由5%增至39%；18～23 min，甲醇体积分数为39%，流速降为0.8 mL／min；23～26 min，甲醇体积分数由39%减至 5%，流速恢复至 1 mL／min；26～30 min，甲醇体积分数为5%。

1.3 样品前处理

称取约5 g混合均匀的乳酸菌饮料样品(精确至0.001 g)于50 mL容量瓶中，加入12%乙酸锌溶液与12%亚铁氰化钾溶液各2 mL沉淀蛋白，加水至标线，摇匀，放入超声波振荡器中超声波提取10 min，放入冰箱冷藏沉淀20 min。将样品转入离心管中以7000 r／min离心5 min，取上清液过0.45 μm尼龙滤膜，供上机待测。

1.4 测定

(1)标准储备液的配制

乙酰磺胺酸钾(安赛蜜)、苯甲酸、山梨酸标准溶液、糖精钠标准储备液可直接配制使用。天门冬酰苯丙氨酸甲酯(阿斯巴甜)标准物质，经100℃减压干燥4 h至恒重，准确称取50.0 mg至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，浓度为1.00 mg／mL。

(2)混合标准使用液的配制

准确吸取乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、阿斯巴甜标准储备液各5.00 mL于100 mL容量瓶中，用水定容，得到质量浓度均为0.05 mg／mL的混合标准使用溶液。分别吸取混合标准使用液1.00，2.00，4.00，8.00 mL 于 10 mL 容量瓶中，各加水至标线得到含乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、阿斯巴甜标准浓度为 5.00，10.00，20.00，40.00 mg／L的混合标准系列溶液。

(3)标准曲线的绘制

对乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、阿斯巴甜标准浓度为 5.00，10.00，20.00，40.00 mg／L的混合标准系列溶液以自动进样器各进样20 μL，进行HPLC分析，然后以峰面积为纵坐标，以乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、阿斯巴甜的浓度为横坐标，进行线性拟合，绘制标准曲线。

(4)样品测定

以自动进样器取样品处理液20 μL进样，以保留时间定性，根据外标法以峰面积定量。

2 结果与讨论

2.1 检测波长选择

在200～300 nm范围内，用紫外–可见光分光光度计检测乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、天门冬先苯丙氨酸甲酯5种物质，发现其敏感波长分别为 226，229，260，202，200 nm。因此选择 230 nm为起始检测波长，后期利用可变波长检测器的波长切换功能将扫描波长变更为205 nm，以达到不同波长吸收范围的物质都能有较大响应值。

2.2 流动相的选择

5种组分极性的较大差异是它们能彻底分离的先决条件，为了使各组分能够很好的分离，分别对流动相的pH值以及洗脱梯度等条件进行了优化[8]。实验对比了乙酸铵–甲醇与硫酸铵–甲醇流动相体系。结果表明，0.02 mol／L乙酸铵与甲醇体系的分离洗脱效果最佳，而以硫酸铵(0.02 mol／L)–甲醇为流动相体系时，乙酰磺胺酸钾(安赛蜜)和天门冬酰苯丙氨酸甲酯(阿斯巴甜)峰形有一定程度的拖尾现象；当乙酸铵缓冲液的pH值分别为4.0，5.0，6.0时，pH值的变化对5种标准物质保留时间及峰形均产生不同程度的影响。当乙酸铵缓冲溶液的pH值为4.0时，峰形出现拖尾现象，且山梨酸与糖精钠出峰时间换位。当乙酸铵缓冲溶液pH 5.0时，峰形得到改善，但对称性达不到实验要求。当乙酸铵缓冲液的pH 6.0时，峰形对称，拖尾现象有明显改善。因此确定pH值为6.0的乙酸铵缓冲液为流动相。以乙酸铵(0.02 mol／l)–甲醇体积比为95∶5为流动相对组分进行分离时，阿斯巴甜在30 min内无法检出，因此采用梯度淋洗，14 min后增加甲醇比例，调整为乙酸铵(0.02 mol／L)–甲醇体积比61∶39，加强了洗脱强度，缩短了分析时间。

通过对流动相比例调整、梯度安排、pH值调节，并利用可变波长检测器的特征对检测过程中不同波长的选择试验，最终确定了1.2最佳实验条件。检测器用变波长扫描：0～13 min内，波长为230 nm；13～30 min内，波长为205 nm。此条件下，5种标准物质能完全分离且峰形对称，一次进样分析时间可控制在25 min。图1、图2分别为混合标准溶液色谱图和乳酸菌饮料样品色谱图。

2.3 样品前处理沉淀剂的选择

样品中的蛋白质对色谱系统尤其是液相色谱柱会产生不良影响，应在前处理过程中沉淀蛋白，根据现行国家标准GB／T 5009.29–2003，使用5%硫酸铜沉淀蛋白质，对于含蛋白较少的食品尚可，但对于乳制品等高蛋白含量的食品则沉淀效果不太理想[9]。实验选择下面3组蛋白沉淀剂进行比较试验。

(1)12%乙酸锌溶液2.0 mL 和12%亚铁氰化钾溶液2.0 mL；

(2)12%乙酸锌溶液2.0 mL 和20%氢氧化钠2.0 mL；

(3)无水乙醇10 mL。

采用方案(1)12%乙酸锌溶液2.0 mL和12%亚铁氰化钾溶液2.0 mL为沉淀剂沉淀蛋白，实验结果表明此两种沉淀剂不干扰目标物的检测，操作简单，沉淀快速。5种标准物质的加标回收率均在80%以上；采用方案(2)12%乙酸锌溶液2.0 mL和20%氢氧化钠2.0 mL为沉淀剂，发现此沉淀条件下苯甲酸和糖精钠的加标回收率均比较理想，但由于使用了氢氧化钠，待测样品溶液碱性增强，对C18分析柱的寿命有一定影响；而选择方案(3)无水乙醇10 mL，须在水浴锅中对样品进行加热，使蛋白质变性，操作复杂，且沉淀剂用量较大，引入干扰概率加大，对加标回收有一定负面影响。

综上所述实验选用(1)12%乙酸锌溶液2.0 mL和12%亚铁氰化钾溶液2.0 mL作为乳饮料的蛋白沉淀剂。

2.4 线性关系及检出限

在实验条件下，按1.4(3)绘制标准曲线，5种目标分析物的浓度x(mg／L)与峰面积y之间呈良好的一次线性关系，线性方程、相关系数、检出限见表1。由表1可知，相关系数大于0.9996，检出限为0.01～0.05 mg／L。检出限计算方法为：配制1个低浓度样品进行测定，计算其信噪比，然后以该浓度除以信噪比再乘以3倍，即该方法对该物质的检出限。

表1 线性回归方程、相关系数

2.5 样品加标回收和精密度试验

对乳酸菌饮料样品进行3水平添加回收试验，每个添加水平取5个平行样，加标回收试验色谱图见图3，回收试验结果见表2。

由表2可知，加标回收率为90%～102%，测定结果的相对标准偏差(RSD)为1.1%～4.3%，各组分检出限均为0.5 mg／kg，说明本实验的回收率与精密度较高，准确度和精密度符合实际样品的检测要求。

表2 回收试验和精密度试验结果(n＝5)

3 结语

研究了高效液相色谱同时测定乳酸菌饮料中乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、天门冬先苯丙氨酸甲酯5种食品添加剂的提取和分析条件，建立了合适的样品提取的前处理方法，并对高效液相色谱条件进行优化，建立了最佳色谱条件。方法灵敏度、精密度和准确度均较高，符合检测要求。同时操作简便、快捷，能在30 min 内将5种添加剂基本分离，达到日常测定样品的要求。

[1]张晓彤.液相色谱检测方法[M].北京：化学工业出版社，2000:6–44.

[2]黄海龙，庄莉，崔群，等.高效液相相色谱法同时测定榨菜中的10 种食品添加剂[J].化学计量分析，2011，20(5): 20–22.

[3]GB 2760–2011 食品添加剂使用卫生标准[S].

[4]GB／T 5009.29–2003 食品中山梨酸、苯甲酸的测定[S].

[5]GB／T 5009.28–2003 食品中糖精钠的测定[S].

[6]GB／T 5009.140–2003 食品中乙酰磺胺酸钾的测定[S].

[7]GB／T 22254–2008 食品中阿斯巴甜的测定[S].

[8]张秀尧.反相高效液相色谱法同时快速测定食品中常见的8种食品添加剂[J].色谱，2000，18(6): 539–542.

[9]鲁琳，高燕红，许秀敏.乳饮料中5种甜味剂和2种防腐剂的高效液相色谱快速测定法[J].环境与健康杂志，2009，26(8):716–718.