UPLC–MS–MS法测定血液中5种吩噻嗪类药物

赵蒙，王朝虹，刘勇，吕俊岗

(最高人民检察院检察技术信息中心，北京 100040)

吩噻嗪及其衍生品一般称为吩噻嗪类，它能抑制中枢神经系统，具有安眠镇静、镇痛等作用，被广泛用作治疗精神病药物，抑制由于药物、癌症等引起的呕吐，也用于增强麻醉、催眠、镇痛的效能。然而吩噻嗪类药物吸收迅速且易在体内代谢和分解，体液中药物的原型含量很低，特别是在服药18 h后，分布在体内的原药甚少[1]。因此，此类药物分析方法的灵敏度和准确度尤为重要。

目前国内外对体内吩噻嗪药物的检验方法有固相萃取 – 气相色谱法[1]、超高效液相色谱法[2–4]等，但这些方法存在灵敏度低、样品检验过程复杂、分析时间长、阳性结果还需验证等问题。近年来，液质联用法已成为检测各类药物的主要方法，特别是液相色谱–串联质谱法，由于其良好的适用性、定性定量功能及高灵敏度，而被广泛应用于司法鉴定、临床等领域中。笔者建立了血液中5种常见吩噻嗪药物的分析方法，该法快速、稳定、前处理简单、灵敏度高，可有效地应用于法医毒物和临床检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪：TQ–S型，美国沃特世公司；

离心机：Blofuge Primo型号，美国Thermo公司；

震荡器：CUTE MIXER CM–1000型，日本EYELA公司；

甲酸：HPLC级，美国Fisher Scientific公司；

空白血：红十字会血站；

甲醇、乙腈：LC–MS级，美国Fisher Scientific公司；

固相萃取柱：Waters Oasis HLB，30 μm，1 mL／20 mg，美国沃特世公司；

去磷脂板：Ostro 96孔磷脂去除板，美国沃特世公司；

正压提取装置：Positive Prssure–96型，美国沃特世公司；

异丙嗪、泰尔登、氯丙嗪、奋乃静、三氟拉嗪5种吩噻嗪类标准样品：1 mg／mL的甲醇溶液，北京百灵威科技有限公司；

实验用水为Millipore milli–Q Integal 3型高纯水机制。

1.2 液相色谱–串联质谱条件

(1)色谱条件

色谱柱：ACQULTY UPLC HSS SB C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国waters公司)；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液；柱温：35℃；流速：0.5 μL／min ；进样量：5 μL ；梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

(2)质谱条件

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)正离子模式；多反应监测(MRM)模式；毛细管电压：0.5 kV；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流速：800 L／h；碰撞气流速：0.16 mL／min；5种吩噻嗪类药物的质谱采集参数见表2

1.3 样本提取方法

取1 mL血样，加入3 mL 2%甲酸乙腈溶液(4℃冷藏)，涡旋震荡10 min，离心10 min两次(8000 r／min)，取上清液装瓶，待用。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件

用仪器IntelliStart功能，通过蠕动泵将浓度为100 ng／mL的5种吩噻嗪标准液以流速20 μg／mL注射到ESI离子源中。在正离子检测模式下对5种药物进行一级质谱母离子(m／z)分析，得到了准分子离子峰(M+1)；对准分子离子峰进行二级质谱子离子(m／z)分析，自动得到离子碎片信息；选择基线噪音低、响应值高的离子对作为监测离子对；采用多反应监测模式采集数据，并优化各离子对的锥孔电压 Cone(V)、碰撞能电压 Collision(eV)、毛细管电压Capillary(kV)及去溶剂气流速、温度等，确定了1.2(2)的质谱条件。色谱图见图1。

表2 5种吩噻嗪类药物的MS–MS参数

2.2 流动相

分别选用3种流动相0.1%甲酸水溶液、2%氨水水溶液及pH 10的5 mmol／L碳酸氢铵水溶液，用HSS柱分析5种吩噻嗪类药物，比较其响应值，图2为不同流动相及柱子对吩噻嗪类药物的响应变化。由图2可知，选用流动相为0.1%甲酸水溶液通过HSS柱分析后5种吩噻嗪类药物的响应较高，且无干扰，因此采用0.1%甲酸水溶液为流动相。

2.3 样本前处理、基质效应、添加回收率的考察

分别选用过HLB小柱固相萃取、酸化乙腈沉淀蛋白及利用Ostros 96孔板去除磷脂法3种不同的前处理方法，通过提取前、后添加法，按照文献[5]中所述，比较标准品溶液的信号峰面积(Set1)、不同来源基质提取后加标的信号峰面积(Set2)及基质提取前加标的信号峰面积(Set3)。基质效应=Set2／Set1；加标回收率=Set3／Set2。这种考察方法可量化评价基质效应，同时也考察方法的提取回收效率。分别考察高、中、低(0.02，2，20 ng／mL)3个浓度级别、平行6组操作，试验结果见表3。由表3可知，经酸化乙腈沉淀蛋白提取后的样本提取回收率高、基质效应小，且此提取方法操作简单、成本低、稳定性好，测定结果准确，因此选用酸化乙腈沉淀蛋白提取样品。

表3 3种不同前处理方法的比较

2.4 线性方程及检出限

在空白血样中添加不同浓度的5种吩噻嗪类的对照品溶液，浓度分别为 0.01，0.02，0.05，0.2，2，20 ng／mL的血液样品，血样中5种吩噻嗪类药物的质量浓度x在0.05～20 ng／mL浓度范围内与峰面积y呈良好的线性关系。异丙嗪、泰尔登、氯丙嗪、奋乃静、三氟拉嗪的检出限分别为0.02，0.01，0.01，0.01，0.01 ng／mL。血液中5种吩噻嗪类药物的线性范围，线性方程，相关系数，检出限见表4。

2.5 精密度试验

在空白血样中添加不同量的5种吩噻嗪类的混合对照品，得到一系列浓度为0.02，2，20 ng／mL的血液样品，每个浓度点做6个平行样本进行操作，每天监测10次，连续测定3 d，用峰面积计算日内、日间的相对标准偏差，结果见表5。

表4 血液中5种吩噻嗪类药物的线性范围、线性方程、检出限

表5 血液中5种吩噻嗪药物方法的日内、日间精密度

由表5可知，测定结果的相对标准偏差小于7%，说明本方法的精密度较高。

3 结语

采用UPLC–MS–MS法同时检测血液中5种吩噻嗪类药物，该法操作简单、灵敏度高、基质效应低、准确可靠，适用于临床和法医毒物中的检测鉴定。

[1]王芳林，刘耀，封世珍，等.生物体内吩噻嗪药物的分析[C]//第五次全国法医学术交流会论文集.北京，1996: 333–335.

[2]Maria Addolorata Saracino，Mario Amoreb，Elena Baioni.Determination of selected phenothiazines in human plasma by solid-phase extraction and liquid chromatography with coulometric detection[J]. Analytica Chimica Acta，2008，624: 308–316.

[3]Garratt W Ponder，Sandra L Butram，Amanda Adams.Resolution of promethazine，ethopropazine，trimeprazine and trimipramine enantiomers on selected chiral stationary phases using high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A，1995，692: 173–182.

[4]Einosuke Tanaka，Takako Nakamura，asaru Terada，et al. Simple and simultaneous determination for 12 phenothiazines in human serum by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography B，2007，854: 116–120.

[5]Matuszewski B K，Constanzer M L，Chavez-Eng C M.Strategiesfor the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC–MS／MS [J]. Anal Chem，2003，75: 3019–3030.