低氧对小鼠旷场行为的影响

尉晓娜，谢于鹏，夏誉，何金彩

（温州医学院附属第一医院 睡眠中心，浙江 温州 325000）

低氧是特殊的单因素温和暴露刺激，目前关于低氧对脑损害的研究主要体现在认知功能方面，大量研究发现不同的低氧可以引起青年鼠空间参考记忆的损害[1-3]。但低氧对小鼠旷场实验行为影响的研究甚少。有报道称，在旷场活动中，急性低氧可以引起新生鼠水平运动、垂直运动增加[4-5]，但是长期低氧尤其是不同种类的长期低氧对小鼠旷场活动的影响报道少见。本实验对不同时间低氧对成年小鼠旷场实验行为、体质量的影响进行探讨。

1 材料和方法

1.1 实验动物及材料设备 6月龄雄性C57BL/6J小鼠34只（购自上海斯来克实验动物有限责任公司），体质量23～28 g，清洁级动物，按国家标准啮齿类动物分笼饲养，自由进食饮水。饲养条件：室温（22±2）℃之间，湿度45%～55%。常压低氧动物饲养舱购自长沙华曦电子科技有限公司，压缩高纯度氮气（浓度＞99.99%）（温州市申鹿气体有限公司），旷场实验及视频分析软件（北京硕林苑科技有限公司）。

1.2 实验方案 按每天低氧时间不同随机分成4组：低氧1组（8 h/d，n=9），低氧2组（12 h/d，n=8），低氧3组（24 h/d，n=9），正常氧浓度对照组（n=8）。低氧组小鼠在低氧舱中饲养8周后，检测所有小鼠旷场实验的行为变化并检测其体质量、心重指数变化。

1.3 模型的建立 所有低氧组小鼠暴露在常压低氧动物饲养舱内以普通饲料、普通饮水饲养。氧舱内条件：吸入O2浓度为8%～10%，CO2浓度低于1%，温度为（22±2）℃，湿度为45%～55%。动物自由摄食摄水，每周7 d，连续8周。每隔3～4 d花10 min左右清洗笼子。对照组小鼠在正常氧浓度条件下饲养，CO2浓度、温度、湿度、饮用水、饲料与低氧组小鼠相同。

1.4 旷场实验 参照文献[6]。旷场实验箱是长×宽×高为50 cm×50 cm×40 cm的黑色箱，底部画有虚拟的16个小正方格，分成沿侧壁的外周格（12个小方格），其余的中央格（4个小正方格），正上空有录像检测系统并与计算机分析软件系统相连。实验开始时，操作者轻轻将小鼠放在正中央区，系统开始同步自动记录小鼠5 min穿越每个格子的时间、路程。实验结束后用毛巾蘸取低浓度酒精擦拭箱底，等待其挥发消散避免留有气味影响其他小鼠的实验结果。

1.5 心重指数 实验结束后称每只小鼠的体质量，处死小鼠，分离心脏，算出每只小鼠的心重指数（心脏质量/体质量）。

1.6 统计学处理方法 所有数据用SPSS16.0软件包进行分析。多个样本间计量资料的比较采用单因素方差分析法，两两比较方差齐者采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett’s T3检验。

2 结果

2.1 旷场实验结果

2.1.1 小鼠穿越格子次数：见表1。与对照组比较，低氧1组小鼠总格数、中央格、外周格穿越次数均明显增加，与对照组间的差异有统计学意义（P<0.01），低氧2组小鼠外周格、总格也明显增加与对照组间差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05），低氧3组增加不明显。低氧1、2、3组增加幅度依次变小。

2.1.2 小鼠跨越不同区域的路程：见表2。与对照组比较，低氧1组小鼠总路程、中央路程、外周路程明显增多，与对照组间的差异有统计学意义（P<0.01），低氧2组小鼠外周路程、总路程也明显增多，与对照组间的差异有统计学意义（P<0.05），低氧3组增加不明显。低氧1、2、3组增加幅度依次变小。

表1 各组小鼠穿越格子次数比较（次±s）

表1 各组小鼠穿越格子次数比较（次±s）

与对照组比：aP＜0.05，bP＜0.01；与低氧3组比：cP<0.05

低氧1低氧2低氧3对照9898 26.56±9.15bc 16.63±1.72 10.11±2.55 4.15±0.99 80.22±19.30bc 60.38±3.47b 39.89±7.88 16.88±4.77 106.78±28.41bc 77.00±4.69a 50.00±10.37 21.00±5.72

表2 各组小鼠跨越不同区域的路程比较（m±s）

表2 各组小鼠跨越不同区域的路程比较（m±s）

与对照组比：aP＜0.05，bP＜0.01；与低氧3组比：cP<0.05

组别低氧1低氧2低氧3对照n9898中央1.45±0.52bc 0.96±0.16 0.51±0.17 0.14±0.08外周7.06±1.65bc 5.41±0.24a 3.66±0.63 1.60±0.41总路程8.51±2.16bc 6.37±0.28a 4.17±0.78 1.75±0.47

2.1.3 小鼠旷场实验中各区域停留时间：见表3。低氧暴露后，各低氧组小鼠主要停留在外周区，低氧组与对照组比较在中央区、外周区停留时间差异均无统计学意义（P>0.05）。

表3 各组小鼠旷场实验中各区域停留时间比较（s±s）

表3 各组小鼠旷场实验中各区域停留时间比较（s±s）

组别低氧1低氧2低氧3对照n9898中央18229.78±3490.45 27027.63±9332.59 13885.00±5688.21 6015.88±2999.26外周274555.22±3526.31 267327.75±9300.20 280274.78±5567.06 289886.75±2977.39

2.2 低氧暴露对小鼠体质量及心脏的影响 见表4。与对照组比较，各低氧组小鼠体质量均减轻，低氧3组小鼠体质量减轻最明显且与对照组间差异有统计学意义（P<0.01）；与对照组比较，低氧1、2、3组小鼠心重指数依次增大。

表4 低氧前后各组小鼠体质量及心重指数变化（±s）

表4 低氧前后各组小鼠体质量及心重指数变化（±s）

与对照组比：aP＜0.05，bP＜0.01；与低氧3组比：cP<0.01

组别低氧1低氧2低氧3对照n9898低氧前体质量(g)24.56±0.50 24.38±0.63 24.78±0.68 25.63±0.68低氧8周体质量(g)24.33±0.44bc 24.50±0.38ac 19.44±0.53bc 26.38±0.71c心重指数(×10-3)4.54±0.13c 4.64±0.13c 5.60±0.24b 4.28±0.16bc

3 讨论

低氧后小鼠体质量明显下降，心重指数明显增加，与对照组比较差异有统计学意义；每日低氧时间越长小鼠体质量下降越明显，心脏损害越严重，这说明低氧模型建立成功。

低氧是种温和刺激，与重复电刺激、强迫游泳[7]等不同，避免了因刺激本身产生的疼痛厌恶情绪对小鼠旷场实验行为的影响。旷场实验可用于测试动物的活动量、活跃程度、探索行为及对新空旷环境的认知能力，还可测评焦虑情绪。小鼠对开阔的新环境具有躲避倾向，这与小鼠先天喜欢在周边区活动的习性有关。

本实验采用旷场实验检测低氧后成年小鼠旷场实验活动变化。低氧后小鼠的外周格穿越次数、中央格穿越次数、总格穿越次数及相应的路程均增加，说明低氧可以引起小鼠活动量的异常增加，这与以前研究结果[4，8]一致。小鼠活动与脑结构的完整性有关[8]，低氧后小鼠活动增加可能与低氧引起运动皮层结构改变有关系[4]。另外小鼠在旷场内的行为受活动能力和情绪改变（动机、焦虑和应激）两方面的影响[9-10]，很难确定到底是哪个因素引起的活动能力改变，具体机制有待进一步探讨。所有实验小鼠的外周区停留时间明显长于中央区停留时间，这与小鼠先天对空旷环境产生恐惧，喜欢沿壁活动的习性有关，并且说明低氧并不能改变小鼠的活动习性。与对照组相比，低氧后小鼠中央区停留时间并无显著延长，说明低氧对小鼠新环境认知能力影响不是很明显。

总之，低氧可以引起小鼠旷场实验中活动的增加及体质量下降，随着每日低氧时间的延长，小鼠自发活动异常增加的幅度反而下降，具体机制有待进一步研究。

[1] 叶小军,陈松芳,王小同,等.川芎嗪对慢性低O2高CO2大鼠空间学习记忆的影响[J].温州医学院学报,2007,37(2):145-146.

[2] Dusek JA, Eichenbaum H. The hippocampus and memory for orderly stimulus relations[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(13):7109-7114.

[3] Mayes A, Montaldi D, Migo E. Associative memory and the medial temporal lobes[J].Trends Cogn Sci,2007,11(3):126-135.

[4] Levshina IP, Mats VN, Pasikova NV, et al. Comparison of the behavior of rats after immobilization with structural changes in the motor cortex[J]. Neurosci Behav Physiol,2009,39(9):915-919.

[5] Iuvone L, Geloso MC, Dell’Anna E , et al. Changes in open field behavior, spatial memory, and hippocampal parvalbumin immunoreactivity following enrichment in rats exposed to neonatal anoxia[J].Exp Neurol,1996,139(1):25-33.

[6] 范新六,李峰,宋月晗,等.四慧合剂对睡眠剥夺大鼠旷场及高架十字迷宫行为的影响[J].天津中医药,2011,28(2):142-144.

[7] 李欢欢,林文娟,李俊发.强迫性冷水游泳应激对大鼠行为和海马神经颗粒素的影响[J].心理学,2005,37(3):366-372.

[8] Ten VS,Wu EX,Tang H, et al. Late measures of brain injury after neonatal hypoxia-ischemia in mice[J].Stroke,2004,35(9):2183-2188.

[9] Ireland Z,Dickinson H,Fleiss B, et al. Behavioural effects of near-term acute fetal hypoxia in a small precocial animal,the spiny mouse (Acomys cahirinus)[J]. Neonatology,2010,97(1):45-51.

[10] Karl T, Pabst R, von Horsten S. Behavioral phenotyping of mice inpharmacological and toxicological research[J]. Exp Toxicol Pathol,2003,55(1):69-83.