高效液相色谱法测定酸模各部位大黄素含量

黄爱芳，林崇良，蔡进章，林观样

（1.温州医学院附属第一医院 药剂科，浙江 温州 325000；2.温州医学院附属第二医院 药剂科，浙江温州 325003）

酸模（Rumex acetosa L.）为蓼科植物，全草均可入药。主要功能有凉血、解毒、通便、杀虫。现代药学研究表明其具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节和抗感染作用，以及对心血管和肝脏功能的调节作用[1]。酸模主要含大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、白藜芦醇、酸模素等化学成分[2]。大黄素具有广泛的生物活性，具有抗菌抗病毒、抗感染、改善肝肾功能、免疫调节和抗肿瘤等作用[3]。为更好地控制药材的质量，本实验对酸模不同药用部位进行大黄素含量测定。

1 材料

1.1 仪器 美国Agilent 1100系列液相色谱仪（四元泵），紫外检测器；UPWS超纯水器（杭州永洁达净化科技有限公司）；TU-1901紫外分光光度计（北京普析通用）；KQ-5000DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂和药品 大黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：756-8902）；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。药材样品采自温州瑞安荆谷乡，经温州医学院附属第一医院药剂科林观样老师鉴定为蓼科酸模。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱Zorbax Ecilpse XDB-C18（4.6 mm×150.0 mm，5μm）；流动相为甲醇：1%冰醋酸=70:30（V:V）；流速：1.5 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：20μL。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品5.0 mg，以甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，配成500μg·mL-1的溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取新鲜酸模根、根茎与叶适量于10 ℃阴干。精密称取根、根茎和叶各5 g研细，置于100 mL具塞锥形瓶中。加入甲醇25 mL，称定，50 ℃超声提取30 min，冷却，再称定，以甲醇补足损失的质量。取1 mL上清液，8000 r/min离心15 min，取上清液600μL备用。

2.4 线性关系考察 取500μg·mL-1的对照品溶液，用甲醇稀释为500、200、50、10、5、1μg·mL-1，按上述色谱条件测定，每个浓度重复3次，进样量为20μL。以对照品峰面积积分值为纵坐标，以进样浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程为：Y=24.862X+29.723（R=0.9995）。表明大黄素在1～500μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液20μL，按上述色谱条件重复进样6次，测得大黄素峰面积积分值RSD为1.97%（n=6），表明本法精密度良好。

2.6 稳定性试验 将供试品溶液在室温下储存，在相同色谱条件下，精密吸取同一供试品溶液20μL，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定大黄素峰面积积分值，得RSD=2.34%（n=6），表明供试品溶液在试验期间基本稳定。

2.7 重复性试验 按“2.3”项制备方法平行配置同一批供试品溶液6份，分别进样测定大黄素峰面积积分值，得RSD=2.06%（n=6）。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量（136.02 μg·mL-1）阴干酸模根茎0.5 g各6份研细，分别精密加入大黄素对照品（50μg·mL-1）10、20、30 mL，按样品溶液制备方法以及上述色谱条件，测定大黄素峰面积，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

图1 HPLC图

2.9 样品含量测定 精密称取阴干后酸模根、根茎和叶各5 g（n=6），按“2.3”项制备方法制备供试品溶液，精密吸取20μL供试品溶液进样，测定大黄素含量。HPLC图见图1，结果见表2。

表2 样品中大黄素含量测定结果（n=6）

3 讨论

3.1 流动相的选择 预实验中我们选择了两种流动相系统进行实验，甲醇:0.1%磷酸=70:30（V:V）与甲醇:0.1%冰醋酸=70:30（V:V），结果均能达到满意的分离效果，大黄素峰均达基线分离，峰型对称。但前者出峰时间太晚，保留时间17.5 min，故选择甲醇:0.1%冰醋酸=70:30（V:V）作为流动相。

3.2 提取方法与提取条件的选择 通过与水提法和醇提法大黄素提取率的比对，我们选择了超声辅助提取法，具有实验操作简便，产物提取率高的优点。制备供试品溶液过程中，选择提取溶剂的种类以及超声提取时间和温度作为考察因素，每个因素取三个水平进行正交试验，结果用甲醇50 ℃超声提取30 min为最佳提取条件。离心过程低于15 min，部分样品的上清液静置后仍会出现沉淀现象，故上清液离心时间应不小于15 min。

3.3 大黄素含量比较 结果表明，酸模根大黄素含量为2.7204 mg·g-1，酸模根茎大黄素含量为2.5966 mg·g-1，酸模叶大黄素含量为0.058 mg·g-1，各部位大黄素含量存在差异，酸模根与根茎大黄素含量明显高于叶中大黄素含量，具有提取价值。本实验可为酸模药材质量控制提供实验室依据。

[1] 张广庆,赵海鹏,王振月,等. 酸模属植物的化学成分与药理活性研究进展[J].世界科学技术-中医药现代化,2008,10(5):86-93.

[2] 王振月,左月明,康毅华,等.毛脉酸模化学成分的研究(Ⅱ)[J].中草药,2005,36(11):1626-1627.

[3] 丁艳,黄志华.大黄素药理作用研究进展[J] .中国药理与临床,2007,23(5):236-238.