MTHFR基因多态性与脑卒中的关系研究

肖湘雪，白树风

（1.河南科技大学医学院，河南 洛阳 471000；2.河南科技大学第一附属医院 神经内科，河南 洛阳 471000）

MTHFR基因多态性与脑卒中的关系研究

肖湘雪1，白树风2＊

（1.河南科技大学医学院，河南 洛阳 471000；2.河南科技大学第一附属医院 神经内科，河南 洛阳 471000）

＊通讯作者

缺血性卒中是由环境因素和多种遗传因素共同作用所致的复杂疾病，其发生的具体机制尚未完全明了。基因变异是脑血管病发病的重要因素之一［1，2］，它通过直接影响个体对环境因素的反应性，通过影响缺血性卒中的病理生理学过程，以及影响其他脑血管病的危险因素来间接影响个体对脑血管病的易感性，其中高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinernia，Hcy）被普遍认为是脑血管病发生的一个独立危险因素［3］。同型半胱氨酸在人体内代谢途径中最关键的酶是亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR），其含量不足或活性下降都直接导致同型半胱氨酸在体内大量蓄积，引起高同型半胱氨酸血症。研究发现，四氢叶酸还原酶基因的碱基突变，尤其是C677T碱基突变，是引起四氢叶酸还原酶缺乏或活性下降的最常见原因［4］。本研究应用PCRRFLP方法研究人群中四氢叶酸还原酶基因C677T碱基多态性与缺血性卒中的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料来源

选取2010年2月-2011年7月我院神经内科收治的325例缺血性脑卒中患者为观察组，男242例，女83例，年龄36－82岁，平均（62.5±12.57）岁，所有患者均符合中华医学会神经病学分会－各类脑血管疾病诊断要点，并经CT和（或）MRI扫描确诊。其中247例为新发生脑梗死，78例为进展性脑梗死。同时选取108例健康体检者为对照组，对照组男78例，女30例，28－79岁，平均（60.75±15.73）岁，排除冠心病、高血压、糖尿病脑血管疾病、癌症、肾功能不全等疾病。

1.2 方法

采用限制性内切酶片段长度多态性方法。（1）提取基因组DNA：取受试者清晨空腹外周静脉血，常规酚－氯仿处理，采用无水乙醇沉淀法提取基因组DNA。（2）PCR体外基因扩增：用2%琼脂糖凝胶电泳检查PCR 产物，PCR 反应体系25μl：25 mmol／L 的 MgCI21.5μl、10×buffer2.5μl、10 mmol／L 的dNTP 1μl、引物1μl（10Pm）、TaqI聚合酶1U和模版DNA 6μl。38个循环：94C3Os、56C5Os、72C1min和72C10min；扩增条件为94℃5min；引物序列为5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3’；扩增 片断长 度为 198bp。（3）PCR-RFLP分析：将2μl的10×buffer、10U的HinfI加入20μl扩增产物反应体系内消化3h，电泳用3%琼脂糖凝胶，在紫外透射仪下观察结果。共检测出3种基因型：CC型仅有1条198bp片段；纯合子突变为TT型，含有175bp片段；杂合子突变为CT型，含有2条片段，分别为198bp和175bp。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 各组Hcy水平的比较

325例患者血浆 Hcy平均水平（17.02±8.02 μmol／L）显著高于健康对照者（12.56±5.22μmol／L）；78例进展期缺血性卒中患者血浆Hcy测定结果显著高于缺血性卒中组整体平均水平，卒中组Hcy水平同时明显高于健康对照者水平，见表1。

表1 进展期缺血性脑卒中患者与健康对照者血浆Hcy比较

2.2 MTHFR基因多态性与Hcy水平的关系

MTHFR基因不同基因型血浆同型半胱氨酸水平（Hcy）测定结果见表2，TT基因型Hcy水平明显高于TC、CC基因型（P＜0.05），TC型基因型Hcy水平观察组显著高于对照组，结果见表2。

2.3 观察组与对照组MTHFR基因型频率和等位基因频率分布比较

观察组与对照组MTHFR基因型频率差异无显著性（P＞0.05），TT纯合子率和T等位基因频率差异比较无显著意义（P＞0.05），具体分布结果见表3。

表2 观察组与对照组MTHFR基因多态性与Hey的关系

表3 观察组与对照组MTHFR基因型及等位基因频率的分布 例（%）

3 讨论

血浆同型半胱氨酸（Hcy）是一种氨基酸，早在1969年McCully就提出Hcy血症可导致动脉粥样硬化性血管病的假说［6］。国内外越来越多的研究也证实动脉粥样硬化性心脑血管疾病与血浆Hcy水平升高具有相关性。Framingham心脏中心对1 041例老年患者进行调查发现，阻塞性血管疾病与血浆Hcy浓度的增高有密切关系［7］。本研究对325例缺血性卒中患者Hcy水平与对照组进行比较发现，缺血性卒中患者血浆Hcy水平较对照组显著升高，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），并且进展期缺血性卒中患者血浆Hcy水平明显高于缺血性卒中组患者血浆Hcy整体平均水平（P＜0.05）。血浆Hcy升高可导致氧自由基生成，引起血管内皮细胞损伤，对内皮细胞造成毒性作用，促进低密度脂蛋白氧化，激活血小板的聚集和黏附，促进泡沫细胞形成，影响凝血因子功能，促进心房内血栓形成，导致栓塞性事件的发生。本研究结果也表明，观察组血浆同型半胱氨酸水平显著高于对照组，提示高同型半胱氨酸血症可能与缺血性卒中的发生具有一定相关性。

N5、N10一亚甲基四氢叶酸还原酶（5、10-MTHFR）是一种黄素蛋白，四氢叶酸还原酶基因包括10个内含子和11个外显子，定位于染色体1P36.3，cDNA全长2.2kb。5、10一亚甲基四氢叶酸还原酶可使亚甲基四氢叶酸还原为甲基四氢叶酸，是同型半胱氨酸代谢过程中的关键酶之一，主要参与同型半胱氨酸的再甲基化过程。国外研究发现，第4外显子的C677T位点碱基突变后可以产生3种基因型，是最常见的碱基突变［8］。C677T碱基突变可产生Hinfl限制酶酶切位点，从而改变四氢叶酸还原酶的热敏感性而使该酶活性发生变化，突变后杂合子酶活性为正常的65%左右，纯合子酶活性只是正常的30%左右。Kluijtmans等［9］经过研究得出CC基因型的四氢叶酸还原酶活性最高，CT基因型的四氢叶酸还原酶活性中等，TT基因型的四氢叶酸还原酶活性最低，血浆Hcy水平随着四氢叶酸还原酶酶活性的下降而呈不同程度升高。本试验通过限制性内切酶片段长度多态性技术检测四氢叶酸还原酶基因型的多态性，并测定血浆Hcy水平，结果显示，四氢叶酸还原酶基因677位点3种基因型中，TT基因型 Hcy水平（25.38±12.12μmol／L）较TC、CC基因型 Hcy水平（14.48±4.92μmol／L和12.58±4.12μmol／L）明显升高，且差异有统计学意义（P＜0.05）。

有大量研究显示，中老年脑卒中发病的独立危险因素之一是高同型半胱氨酸血症，且血浆同型半胱氨酸水平越高远期生存率越低。有学者对正常人和缺血性脑血管病患者血浆同型半胱氨酸水平和四氢叶酸还原酶基因多态性测定结果进行对比发现，血浆同型半胱氨酸水平与缺血性脑血管病密切相关，未发现缺血性脑血管病与MTHFR基因多态性有显著关系［10］。也有学者于2004年采用高效液相色谱法对300名卒中患者和300名正常对照者进行血浆同型半胱氨酸水平测定，同时用限制性内切酶片段长度多态性方法对四氢叶酸还原酶基因677位点基因型进行检测，结果发现，缺血性卒中患者血浆同型半胱氨酸水平显著升高，而四氢叶酸还原酶基因多态性与脑卒中的发生无相关性［11］。本研究结果显示，缺血性脑血管病患者血浆Hcy水平与对照组间有显著性差异，编码MTHFR基因677位点的TT突变纯合子血浆Hey水平也显著高于CT杂合子和CC无突变纯合子，但两组间TT突变纯合子率和T等位基因率相比差异无显著性，因此，MTHFR基因多态性与缺血性卒中相关性不甚明确，这与其他学者研究结果相符。

综上所述，血浆同型半胱氨酸水平可能是缺血性脑卒中的独立危险因素，MTHFR基因C677T位点突变纯合基因型TT型较CT基因型、CC基因型血浆Hcy升高明显，提示TT基因型MTHFR酶活性最低，MTHFR基因C677T突变位点多态性与脑卒中无明显相关性。

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1007－4287（2012）07－1311－03

2012－01－16）