靶向干扰Survivin基因对结直肠癌细胞PTTG蛋白的影响

史美龙

（吉林省人民医院 基本外科，吉林 长春 130021）

靶向干扰Survivin基因对结直肠癌细胞PTTG蛋白的影响

史美龙

（吉林省人民医院 基本外科，吉林 长春 130021）

目的 探讨重组载体介导的Survivin小干扰RNA（siRNA）对人结肠癌细胞株Lovo中PTTG蛋白的影响。方法运用靶向Survivin siRNA真核表达载体转染结肠癌Lovo细胞，western blot检测PTTG蛋白的表达水平。结果Survivin基因沉默后24－72h，与正常对照组相比，Survivin和PTTG蛋白表达均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论Survivin基因沉默后结直肠癌细胞PTTG蛋白表达显著下调，提示Survivin和PTTG可能相互促进共同参与结直肠癌的发生发展。

结直肠癌；免疫印迹；RNA干扰；垂体瘤转化基因

（ChinJLabDiagn，2012，16：1174）

结直肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，其发病率位居恶性肿瘤的第四位，且呈现明显上升趋势，尽管可以采取积极手术治疗，但绝大多数病人仍难免死于肿瘤复发及转移，其死亡率高居第三位。因此，探索新的更为有效的辅助防治方法就显得尤为必要。本课题前期利用pGenesil-2真核表达载体构建了靶向干扰Survivin的重组载体，发现Survivin基因沉默可明显抑制结直肠癌细胞增殖，提示下调Survivin基因表达有望作为结直肠癌治疗新的分子 靶 点［1，2］。 为 明 确 其 作 用 机 制，本 研 究 运 用Wstern blot检测Survivin基因沉默后垂体瘤转化基因（PTTG）的表达，旨在为阐明Survivin在结肠癌发生发展中的作用及基因治疗的分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒构建与抽提

将本实验构建的重组质粒pGenesil-2-control（非同源干扰序列插入 pGenesil-2）和 pGenesil-2-Survivin 1（插入靶向Survivin基因5’-GGACCACCG CATCTCTACA-3’目的片段干扰序列的pGenesil-2干扰载体）以及pGenesil-2-Survivin 2（插入靶向Survivin基因 5’-GGCTGGCTTCATCCACTGC-3’目的片段干扰序列的pGenesil-2干扰载体）接种于50ml LB培养液中，37℃、250r／min振摇培养16h。运用质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA（购自Promega公司），按照试剂盒说明书进行。

1.2 细胞转染

37℃、5%CO2培养箱中运用含10%胎牛血清培养本实验室保存的Lovo细胞株。将细胞接种于6孔板中，接种密度约为5×105个／孔。运用脂质体 Lipo 2000 转 染 重 组 质 粒 pGenesil-2-control、pGenesil-2-Survivin 1和 pGenesil-2-Survivin 2，转染方法按照Lipo2000说明书（Invitrogen公司）进行。

1.3 Western blot检测Survivin和PTTG蛋白表达

转染0h、24h、48h和72h后，收集各组细胞（正常对照组、转染质粒pGenesil-2-control组、转染质粒pGenesil-2-Survivin 1组和转染质粒pGenesil-2-Survivin 2组），煮沸法裂解细胞提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量。取20μg蛋白进行SDSPAGE，电泳后转印到硝酸纤维素膜，室温5%脱脂奶粉封闭2h，加入第一抗体（1∶1 000兔抗人Survivin抗体，1∶200兔抗人PTTG抗体，1∶500兔抗人β-actin抗体），室温孵育1h，4℃孵育4h，PBST洗膜3次后加入1∶1 000稀释的兔抗鼠第二抗体孵育1h，PBST洗膜后，ECL显色，凝胶成像分析系统扫描并测定平均光强度值（Average density value，ADV）。将目的蛋白 ADV／β-actin ADV 作为蛋白表达的相对值，每次实验重复3次。

1.4 统计学处理

2 结果

重 组 质 粒 pGenesil-2-control、pGenesil-2-Survivin 1和pGenesil-2-Survivin2转染结直肠癌Lovo细胞后，Survivin和PTTG蛋白表达情况分别见表1、表2。Survivin基因沉默后24－72h，与正常对照组相比，Survivin蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明干扰效果可以满足实验需要。Survivin基因沉默后24－72h后，PTTG蛋白表达较相同时间点显著低于正常对照组（P＜0.05）。图1显示Survivin基因沉默后24h后，Survivin和PTTG蛋白表达情况。

表1 各组转染后不同时间Survivin蛋白表达变化

表2 各组转染后不同时间PTTG蛋白表达变化

图1 转染后24h各组蛋白表达

3 讨论

Survivin是1997年发现的凋亡蛋白抑制因子家族中的一个新成员，具有明显的细胞周期特异性和组织分布特征，参与调节细胞分裂和凋亡。G2／M期细胞特异性高表达Survivin，若过表达超越细胞自身的周期调控时，就会引发肿瘤；相反，Survivin基因缺失的细胞又无法进行正常细胞分裂［3］。结直肠癌中Survivin表达明显增高，并且有淋巴结转移组的阳性率显著高于无淋巴结转移组，预示着结直肠癌生存期缩短和预后不良［4，5］。

近年来，应用反义寡核苷酸靶向抑制survivin表达用于结直肠癌的治疗取得了一定进展。Mesri等报道survivin反义寡核苷酸可消除血管内皮细胞生长因子对抗肿瘤坏死因子或神经酰氨诱导的凋亡作用，促使caspase-3活化，导致内皮细胞凋亡和毛细血管迅速退化［6］。宫向前等运用接种人结直肠癌细胞至裸鼠皮下的方法制作结直肠癌种植瘤模型，分别用survivin反义寡核苷酸、正义核苷酸和生理盐水进行皮下瘤体内注射治疗，发现survivin反义寡核苷酸可以抑制结直肠癌裸鼠移植瘤的生长［7］。王群等运用脂质体将survivin反义寡核苷酸转染结直肠癌细胞株Lovo细胞，发现survivin反义寡核苷酸能增强顺铂诱导的结直肠癌细胞凋亡［8］。提示survivin有望成为新的潜在靶点用于结直肠癌的治疗。

垂体瘤转化基因（PTTG）自1997年从大鼠垂体腺瘤细胞中分离以来即得到了广泛专注。大量研究报道了其与肿瘤的相关性，包括结直肠癌，郑建云等运用免疫组化检测了63例结直肠癌、癌旁及正常组织中PTTG的表达，发现PTTG在癌组织中表达的阳性率明显高于癌旁和非癌组织，并且在中、低分化结直肠癌中的阳性表达明显强于高分化结直肠癌［9］。运用siRNA靶向干扰PTTG表达可抑制细胞生长，增加细胞凋亡［10］。提示PTTG可以作为临床判断结直肠癌恶性生物学行为的分子生物学指标。

关于survivin和PTTG的关系，有研究报道两者在胃癌和神经胶质瘤中均高表达，相关性分析显示两者表达呈显著正相关，提示survivin和PTTG可能在肿瘤的发生发展中具有协同作用，两者存在共同的激活机制，构成肿瘤细胞凋亡的多种途径［11，12］。本研究利用前期已经构建成功的重组载体靶向干扰结直肠癌细胞Survivin基因表达，发现Survivin低表达后24－72hPTTG蛋白含量显著下调，表明Survivin可能与PTTG相互作用共同参与结直肠癌的发生发展，然而，两者相互联系的作用机制尚有待进一步研究。

［1］史美龙.Survivin特异性shRNA表达载体的构建及评价 ［J］.中国老年性杂志，2009，29（11）：1352.

［2］史美龙.Survivin基因小干扰RNA对人结肠癌细胞生物学行为的影响 ［J］.中国老年性杂志，2009，29（14）：1733.

［3］Altieri DC.Targeted therapy by disabling crossroad signaling networks：the survivin paradigm ［J］.Mol Cancer Ther，2006，5（3）：478.

［4］Kawasaki H，Toyoda M，Shinohara H，et al.Expression of survivin correlates with apoptosis，proliferation，and angiogenesis during human colorectal tumorigenesis［J］.Cancer，2001，91（11）：2026.

［5］鲁 蓓，武 欣，王琳冬，等.survivin在结直肠癌中表达及与临床病理特征的关系 ［J］.陕西医学杂，2010，39（2）：169.

［6］Mesri M，Morales-Ruiz M，Ackermann EJ，et al.Suppression of vascular endothelial growth factor-mediated endothelial cell protection by survivin targeting［J］.Am J Pathol，2001，158（5）：1757.

［7］宫向前，乔广东，李玉华，等.Survivin反义核酸治疗人大肠癌裸鼠皮下种植瘤的实验研究［J］.中国现代普通外科进展，2006，9（4）：219.

［8］王 群，李国华，杨建辉，等.Survivin反义寡核苷酸增强顺铂诱导结直肠癌细胞凋亡［J］.世界肿瘤杂志，2002，1（2）：129.

［9］郑建云，刘 冰，任天顺，等.大肠癌中PTTG的表达及意义 ［J］.临床与实验病理学杂志，2010，26（2）：148.

［10］徐松柏，赵红光，赵 刚，等.RNAi沉默PTTG基因对恶性胶质瘤 U251细胞的影响［J］.中国老年学杂志，2008，28（7）：645.

［11］刘振忠，李矿，杨柳，等.胃癌组织Survivin和PTTG表达相关性及其临床意义的研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2010，17（20）：1649.

［12］高卫峰，王宏勤，刘晓东，等.PTTG与survivin在脑胶质瘤中的表达及相关性探讨［J］.中国现代医生，2010，48（16）：11.

The expression of PTTG following survivin gene silencing in colorectal cancer

SHIMei-long.（People’sHospitalofJilinProvince，Jilin130021，China）

ObjectiveTo explore the expression of PTTG following survivin gene silencing in colorectal cancer cell line Lovo.MethodsThe survivin siRNA expression vector and empty expression vector were transfected into Lovo cells by liposome 2000.After the transfection，the expression of survivin and PTTG was detected using western blot.ResultsThe expression of survivin and PTTG was decreased significantly at 24h，48h，and 72hafter survivin gene silencing with siRNA.（P＜0.01）.ConclusionThe expression of PTTG was decreased obviously following survivin gene silencing in colorectal cancer cell line，indicating survivin-PTTG interaction may contribute to the development of colorectal cancer.

Colorectal cancer；western blot；siRNA；PTTG

R735.3

A

1007－4287（2012）07－1174－03

吉林省科技学技术厅国际科技合作（20100753）

2011－08－24）