清开灵注射液对心肌缺血－再灌注损伤大鼠凋亡相关蛋白Caspase表达的影响

赵丽红，赵立勤，于艳华，石 卓

（1.白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000；2.大安市中医院，吉林 大安 131300；3.吉林大学白求恩医学院 药理学系，吉林 长春 130021）

清开灵注射液对心肌缺血－再灌注损伤大鼠凋亡相关蛋白Caspase表达的影响

赵丽红1，赵立勤2，于艳华1，石 卓3＊

（1.白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000；2.大安市中医院，吉林 大安 131300；3.吉林大学白求恩医学院 药理学系，吉林 长春 130021）

目的 探讨清开灵注射液（QKL）对心肌缺血—再灌注损伤后大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白Caspase表达的影响及其作用机制。方法实验共设假手术组、模型组、复方丹参注射液组（DS组）及清开灵注射液组（QKL治疗组），每组8只，各组术前连续舌下静脉给药1周，采用结扎大鼠左冠状动脉前降支40min后，松解再灌注120min，制备心肌缺血—再灌注模型，实验结束后HE染色观察心肌细胞形态学变化，免疫组化观察心肌Caspase-3、Caspase-9表达情况。结果QKL能够下调心肌细胞Caspase-3、Caspase-9表达，从而减少心肌细胞的凋亡。结论QKL对大鼠心肌缺血－再灌注损伤具有保护作用，其保护作用的机制与下调心肌细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9表达有关。

清开灵注射液；心肌缺血－再灌注损伤；凋亡；Caspase-3；Caspase-9

（ChinJLabDiagn，2012，16：1171）

目前的研究表明，心肌缺血－再灌注损伤过程中不但存在细胞坏死，同时亦存在细胞凋亡。心肌细胞坏死一旦启动，则难以控制，但细胞凋亡是受一系列程序调控的过程。因此，调控心肌细胞凋亡成为抑制心肌细胞坏死的重要措施。caspases是细胞凋亡中起关键作用的一组半胱氨酸蛋白酶，主要作用为破坏细胞骨架，因此若能抑制其活性，细胞凋亡过程势必受阻［1］。本研究旨在观察清开灵注射液对caspases表达的影响，初步探讨清开灵注射液在心肌缺血－再灌注损伤过程中的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂及仪器Wistar大鼠，雌雄兼用，清洁级，体重250±30g，合格证号：SCXK-（吉）2003-0001，由吉林大学实验动物中心提供。清开灵（QKL）注射液（北京中药厂生产）。丹参（DS）注射液。Caspase-3、Caspase-9免疫组化检测试剂盒（北京中杉生物有限公司生产）。

1.2 动物模型制作本研究的动物模型制备在经典缺血再灌注模型［2］基础上进行了改良：在20%乌拉坦麻醉下，仰卧位固定，颈部正中分离气管行气管插管，开胸后接呼吸机。小动物呼吸机设定潮气量为09、呼吸频率为66－76次／min，吸呼比为1∶2，根据呼吸频率及深度调整呼吸参数。自左胸3－4肋间开胸，暴露心脏，以肺动脉圆锥与左心耳之间的左冠状静脉为标志，找出左冠状动脉前降支主干。除假手术组外，其余各组均以0号线立即结扎冠脉，打活结，形成心肌缺血后将心脏送回胸腔。结扎冠状动脉40min后，打开活结放松丝线再灌注120 min，形成缺血－再灌注模型。实验中以心电图Ⅱ导联ST段抬高为冠状动脉结扎成功的标志，变化不明显者、穿线中大量出血者剔除实验。

1.3 实验分组及给药各组术前连续舌下静脉给药1周，第七天术前15min舌下静脉给药。后每只大鼠开胸，暴露心脏，穿线，15min后取心电图正常者随机分组。每组8只，分为4组，即假手术对照组、模型组、复方丹参注射液组（阳性对照药DS组）及清开灵注射液组（QKL治疗组）。假手术对照组：冠状动脉下穿线不结扎；模型组：结扎左冠状动脉前降支，以心电图ST段明显抬高。丹参注射液组：舌下静脉给药20mg／kg，15min后结扎左冠状动脉前降支。清开灵注射液组：舌下静脉给药20mg／kg，15min后结扎左冠状动脉前降支。缺血40min后，打开结扎线形成再灌120min。S-T抬高，说明模型成功。

1.4 观察心肌组织形态学的变化每组随机取3只鼠的心尖部分作组化标本置于10%的中性甲醛中室温固定72小时后，常规脱水，石蜡包埋，连续切取数个4μm厚的切片，分别作苏木精－伊红染色（HE染色），观察清开灵注射液对缺血－再灌注损伤大鼠心肌组织的病理组织学变化。

1.5 免疫组化法检测心肌细胞凋亡每标本测定5张切片，每张切片6个视野以视野数为单位，每组共30个视野，用HAIPS-1000高清晰彩色病理图像测量系统进行测量，选取OD值（平均光密度）为半定量参数，测定Caspase-3和 Caspase-9蛋白的表达。

1.6 统计学处理所有数据均以平均值±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析和q检验，百分数采用χ2检验。以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 清开灵注射液对Caspase-3的影响凋亡的心肌细胞核呈现为黄色，棕黄色或棕褐色，主要是心肌细胞，少数为浸润的淋巴细胞和血管内皮细胞。与假手术组比较，模型组Caspase-3表达明显增加；与模型组比较，DS组及QKL组Caspase-3表达明显减少，且QKL组与DS组比较，无明显差异。由此可见QKL可能通过下调心肌缺血再灌注损伤大鼠Caspase-3的表达，进而减少心肌细胞的凋亡，见图1。

图1 清开灵注射液对Caspase-3表达的影响

2.2 清开灵注射液对Caspase-9的影响凋亡的细胞核仍呈现为黄色，棕黄色或棕褐色。与假手术组比较，模型组Caspase-9表达明显增加；与模型组比较，DS组及QKL组Caspase-9表达明显减少，且QKL组与DS组比较，无明显差异。由此可见QKL可能通过下调心肌缺血再灌注损伤大鼠Caspase-9的表达，进而减少心肌细胞的凋亡，见图2。

2.3 清开灵注射液对心肌损伤组织形态学的影响HE染色见对照组（图3A）心肌纤维排列整齐，可见分支，偶见闰盘，细胞核位于肌纤维中央，心肌间质和心肌未见异常。缺血－再灌注组（图3B）可见较大范围的心肌间质水肿灶，心肌间质间隙扩大。在间质水肿灶内可见较多心肌纤维胞浆嗜伊红浓染，胞核浓缩，少数心肌纤维出现溶解、破坏，但局部浸润炎细胞较少，表明模型建立成功。清开灵注射液组（图3D）可见到心肌间质水肿灶，但其范围较缺血－再灌注组明显缩小。在间质水肿灶内可见少数肌纤维胞浆嗜伊红浓染，胞核浓缩，但未见明显肌纤维溶解破坏。少数肌束可见波浪状纤维。模型组（图3B）见内层心肌呈灶状肌纤维间水肿及嗜伊红浓染，病变重于清开灵注射液组。

图2 清开灵注射液对Caspase-9表达的影响

图3 清开灵注射液对缺血－再灌注心肌损伤组织形态学的影响

3 讨论

目前已经表明丹参对心肌缺血－再灌注损伤具有保护作用［3］，故本实验将丹参注射液作为阳性对照药，更直接的表明清开灵注射液的作用。研究表明，Caspases是细胞凋亡中起关键作用的一组半胱氨酸蛋白酶，其中Caspase-3是介导细胞凋亡的核心蛋白酶［4，5］。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，激活的Caspase-3可以裂解多种底物，包括抑制凋亡的蛋白、Caspases酶原、细胞外基质蛋白及骨架蛋白、DNA修复相关分子、与mRNA剪切有关的因子和DNA片段形成因子等，这些底物参于凋亡过程中细胞核、细胞骨架或胞膜结构蛋白的降解，从而导致细胞凋亡［6］；细胞发生凋亡时，Caspase自我活化并相互激活。而Caspase-9，接受到信号后，能通过被酶催化或自剪接而激活，然后引起Caspase级联反应，Caspase-9在级联反应的上游，活化的 Caspase－9进一步激活其下游的Caspase-3，使细胞凋亡 。

在人类细胞中，Caspases的超表达和激活不仅直接破坏细胞结构导致细胞凋亡，而且通过灭活Bcl-2等凋亡抑制物和产生促细胞凋亡的片段而诱导细胞凋亡［7］。研究还表明：Caspases通过裂解核酸内切酶的抑制物而引起DNA片断化（fragmenta2tion），说明Caspases蛋白酶家族是引起细胞凋亡的关键分子群，其中Caspase-3是凋亡信号传导中的关键效应酶，起细胞凋亡执行器的作用［7］。本研究结果显示缺血再灌注早期大鼠心肌中有细胞凋亡参与心肌损伤，缺血40min再灌注120 min后心肌细胞组织切片观察到 Caspase-3、Caspase-9阳性表达的细胞明显增多，应用QKL干预后心肌细胞Caspase-3、Caspase-9阳性表达明显减少，表明QKL能够抑制心肌细胞凋亡的发生，从而在心肌缺血再灌注损伤中起保护作用。这可能是其对大鼠心肌缺血－再灌注损伤具有保护作用的机制。

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Effects of Qingkailing Injection on apoptosis related protein expression of caspase in myocardial ischemia-reperfusion injur- ty rats

ZHAOLi-hong，ZHAOLi-qin，YUYan-Hua，etal.（BaichengMedicalCollege，JilinProvince，Baicheng137000，China）

ObjectiveTo explore the effects of Qingkailing（QKL）on apoptosis in myocardia of rats after ischemicreperfusion.MethodsRats were divided into sham，model，DanShen and Qingkailing groups at random，8rats in each，and were treated with medicines by sublingual vein administration respectively last 1week.All rats were subjected to openning chest then the left anterior desending coronary arteries（LAD）were ligated for 40min and unclamped for 120 min，at the end of，myocardial pathological changes were observed by light microscope after HE dyeing，and measure the apoptotic cells by TUNEL to observe the expressiones of caspase-3and caspase-9by immunohistochemistry.ResultsQKL downregulated the expressiones of Caspase-3，Caspase-9.ConclusionQKL have protective effects on ischemiareperfusion in rats，which may be related to downregulated the expressiones of Caspase-3，Caspase-9during ischemiareperfusion.

Qingkailing myocardial ischemic and reperfusion apoptosis Caspase-3Caspase-9

R541.4

A

1007－4287（2012）07－1171－03

吉林省教育厅“十一五”科学技术研究项目（吉教科合字【2008】第439号）

＊通讯作者

赵丽红（1970-），女，讲师，主要从事心血管药理学教学及研究。

2011－08－07）