运用HRM技术分析7个SNP位点与2型糖尿病相关性

左 玲，左 磊

（1.荆门市第一人民医院，湖北 荆门 448000；2.荆门市疾病预防控制中心，湖北 荆门 448000）

运用HRM技术分析7个SNP位点与2型糖尿病相关性

左 玲1，左 磊2

（1.荆门市第一人民医院，湖北 荆门 448000；2.荆门市疾病预防控制中心，湖北 荆门 448000）

目的 采用高分辨熔解曲线（high-resolution melting，HRM）方法检测7个2型糖尿病（T2DM）患者相关易感单核苷酸多态性，并分析该多态性与2型糖尿病的相关性。方法选取202名T2DM患者和200名健康志愿者，提取外周血DNA，采用HRM技术分析其多态性，并用测序法证实。结果成功地检测T2DM患者相关易感单核苷酸多态性。HRM技术检测能准确区分各种基因型，其结果与测序法一致；研究还显示rs10811661和rs10923931位点在本研究人群中与T2DM无相关，此外rs7961581位点OR值＜1，提示其在中国汉族人群，对于T2DM可能起保护作用；本研究中的rs8050136，rs10811661，rs7578597，rs864745均OR值＞1，可能是疾病风险因素。结论成功地建立了采用HRM的简单、快速和精确地分析T2DM患者相关易感单核苷酸多态性的方法；推测这些易感单核苷酸多态性可能与2型糖尿病发病相关。

2型糖尿病；高分辨熔解曲线；单核苷酸多态性

（ChinJLabDiagn，2012，16：1201）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由于胰岛素分泌不足或作用缺陷引起的以高血糖为主要特征的代谢疾病群，伴有碳水化合物、蛋白质、脂肪代谢异常，严重时常导致酸碱平衡失常［1］。DM一般分为1型、2型、特殊类型和妊娠型共四种类型，其中T2DM占DM患病人数的85%－90%［1］，是由多个基因与环境因子联合作用所引起，呈显著的异质性，如患者的发病年龄不同，胖瘦不同，病情轻重不同，对各种治疗的反应不同，具有较强的遗传易感性。目前T2DM确切病因及发生机制尚不清楚，普遍认为T2DM具有多基因遗传（polygenic inheritance）特点［2，3］。

我们选取了以下7个易感基因位点：①rs8050136位于FTO基因内含子区；②rs10811661位 于 CDKN2A／B 基 因 上 游 125kb 处；③rs13266634编码SLC30A8基因R325W突变；④rs10923931位于NOTCH2基因内含子区，该基因参与胰腺发育；⑤rs7578597编码THADA基因T1187A突变；⑥rs864745位于JAZF1基因内含子区；⑦rs7961581位于TSPAN8／LGR5基因内含子区。这些位点或位于与胰岛素代谢有关的基因附近如HHEX／IDE；或属胰岛素释放相关重要基因，如SLC30A8；或由于与肥胖有关而引起T2DM，如FTO；或与T2DM发生相关核因子，如HNF1B。我们采用HRM对T2DM患者和正常对照检测以上7个位点，并与测序法进行验证，分析该7个位点与T2DM相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

荆门中心市医院等3家医院收集的200例T2DM患者，符台 WHO糖尿病的诊断标准，同时选取202例健康人作为对照组。参与实验对象均签署知情同意书，均为中国湖北汉族人群。

1.2 方法

1.2.1 临床资料：空腹静脉采集血标本，并记录血糖、血脂、BMI等临床资料。

1.2.2 HRM检测：基因组DNA用酚氯仿异戊醇法从外周血细胞提取。采用LightScanner Primer Design软件设计设计相应位点（位点相邻基因及易感等位基因见表1）引物。通过实验比较HRM SNP分型常用的探针法，大片段扩增法和小片段扩增法，最终确定小片段扩增法结果较大片段扩增法准确，且较探针法简便易行，因此后续实验均使用小片段扩增引物（详细小片段扩增法上下游引物见表2。

表1 位点相邻基因及易感等位基因

表2 小片段扩增法上下游引物

由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系包括：PCR扩增体系如下（25μl）：PCR MIX（Takara）5μl、上游引物0.5μl、下游引物 0.5μl、LC Green 1μl、模板DNA 1μl，加双蒸水至10μl体系。扩增程序如下：预变性95℃2min、变性95℃30s、退火55℃30s、延伸72℃30s、变性94℃30 s、退火28℃30s，50个循环、延伸72℃7min，经过以上PCR反应后，得到的目的片段为40－55bp。然后在HR-1仪器上进行高分辨熔解曲线分析，条件为：95℃2min.60℃2min预处理后，熔解温度从60℃到95℃，每升高0.1℃采集一次数据（详细HRM实验程序见表3）。获得高分辨熔解曲线图，进行分析。

表3 高分辨率熔解曲线实验程序

1.2.3 测序分析：用Primer软件设计测序引物见表4。采用表4用引物在ABl 9700扩增仪上扩增。反应体系除不加LC Green染料外其余同前，终体积用去离子水补足25μl。PCR扩增条件同上。送上海华大基因科技股份有限公司测序。

表4 测序引物序列

1.3 统计分析

用χ2检验分析基因型与T2DM的关系，P值小于0.05为差异有统计学意义。同时计算各位点Odds Ratio值（OR值），衡量患病风险（OR值＞1提示患病风险增加）。

2 结果

2.1 运用HRM进行基因分型

采用HRM检测获得各位点三种类型曲线的标准视图（见图1），此三种曲线分别代表不同的基因型，基于AT碱基对比GC碱基对稳定性差的理论，杂合子型稳定性较差，所以在较低的温度就开始解链。

2.1.1 各位点HRM分型结果如图1：

图1 1）-7）各位点HRM分型结果

2.1.2 各SNP位点的测序结果与HRM法比较，HRM检测基因多态性的符合率为100%。

2.2 基因型、基因频率在受检者中分布

运用HRM技术检查了它的等位基因和基因型在不同人群中的分布（表5）。分析不同人群的基因型与临床资料的关系，发现年龄、性别、血糖、血脂在实验组和对照组间没有统计学差异，用χ2检验检测在男性组和女性组内各基因型与等位基因频率分布，发现除rs10811661和rs10923931外，其他位点两组间基因型分布和等位基因型分布有显著差异（P＜O.01），结果见表5。进一步分析有差异位点发现：对于rs7961581位点，其公认的易感等位基因C却在对照组频率较高，分析等位基因Odds Ratio值（OR 值）显 示 （表 6）rs7961581OR 值 ＜1（0.659），提示该等位基因在该人群可能起保护作用。其他有差异位点OR值均大于1，提示对于这些位点携带公认的易感等位基因者，患T2DM风险更高。rs10811661和rs10923931虽然其两组间基因型分布和等位基因型分布无显著差异（P＞0.05），分析其等位基因Odds Ratio值发现，OR值均在 1 左 右，rs10811661 略 大 于 1（1.161），rs10923931略小于1（0.990），提示对该人群这些位点可能与T2DM发病不相关。

表5 基因频率在受检者中分布

表6 等位基因频率分布及OR值

3 讨论

高分辨熔解曲线技术（HRM）是近年来国际上兴起的一种最新的SNP及突变研究工具。核酸的高分辨熔解程度是在一个含有荧光双链DNA结合染料LCGreen Plus和PCR产物的混合物中，将高密度荧光信号转化为温度函数的技术。通过监测DNA解链的荧光信号（图像），以显示出DNA熔解的全过程。样品与样品间比较，则有赖于荧光信号曲线的差异分析。与传统方法相比，具有敏感性高，操作简便，成本低的优势，但正是由于其敏感性高，导致结果易受各种因素影响，因此扩增过程和扩增引物的优化对于其应用至关重要［4，5］。我们通过优化扩增过程和扩增引物，最终得以由小片段扩增实现了对与T2DM相关7个位点的大样本快速简便SNP分型，结果与测序结果相符。

这些等位基因可存在于正常人群中，但具有越多的此类等位基因，患病的可能性就越大。T2DM遗传易感性在不同的人群中和不同的环境下表现不一，可能由多个基因或一个基因中的多个遗传变异共同决定，其中每一个基因或同一基因中的每一个基因变异对疾病性状的贡献较小，如果仅研究单个基因，不易检测出该基因与性状的相关性。通过研究由多个DNA变异，可提高对弱效基因的检出能力［6－8］。以往研究［7］中发现了许多新的易感基因位点与T2DM有关，尽管具体机制尚未明了，但这些遗传多态性或许能为未来的基因治疗的预后提供依据。在其他学者关于基因多态性与T2DM相关性研究中，发现：对于高加索人群，本研究中涉及的7个位点与T2DM相关，但我们的研究显示rs10811661和rs10923931位点在本研究人群中与T2DM无相关，此外rs7961581位点OR值＜1，提示其在中国汉族人群，对于T2DM可能起保护作用，因此基于基因的疾病预测模型，应对该位点做相应处理，而不能与其他位点（如本研究中的rs8050136，rs10811661，rs7578597，rs864745）一样记为疾病风险因素。

总之，我们首次采用HRM对T2DM相关7个SNP位点进行分析，并建立了对该SNP位点检测的简单、快速和精确的SNP分型方法，我们的研究证明rs8050136，rs10811661，rs7578597，rs864745位点可能与中国人T2DM相关，是疾病风险因素。

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Analyzing the relationship between 7SNP loci and type 2diabetes mellitus using high resolution melting curve method

ZUOLing1，ZUOLei2.（1.TheFirstPeople’sHospital，Jingmen448000，China；Hubei；2.JingmenCenterforDiseaseControl，andPrevention，Jingmen448000，China）

ObjectiveSeven single nucleotide polymorphisms were genotyped with the high-resolution melting curve（high-resolution melting，HRM）method，and their relation with type 2diabetes mellitus（T2DM）was analyzed.Meth-ods 202patients with type 2diabetes and 200healthy volunteers were recruited for this study.Peripheral blood were obtained to extract DNA.High-resolution melting curve technology was used to genotype the 7SNPs，and was confirmed by sequencing.The frequency data were submitted to statistical analysis to assess their relation with T2DM.Results1.We successfully genotyped 7T2DM-related SNPs using HRM，the results consistent with the sequencing.2.For rs8050136，rs1081166，rs7578597，rs864745，the disease group showed higher frequency of susceptibility allele and higher disease susceptibility，the difference was statistically significant（P＜0.05，OR＞1），and rs7961581might be a protective factor for T2DM.Loci rs10811661and rs10923931might not be associated with T2DM in this study population.ConclusionWe established a simple，fast and accurate T2DM-relate SNP genotyping method using HRM，and we speculated that these SNPs may be associated with susceptibility to type 2diabetes.

type 2diabetes，high-resolution melting curve.Single nucleotide polymorphisms

R587.1

A

1007－4287（2012）07－1201－05

2012－01－30）