动物多肽毒素及其药物学研究

梁宋平

（湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙410081）

动物毒器是动物在亿万年进化过程中为生存(捕食和防卫)而形成的高度特化器官，其产生的毒液中含有丰富多样的专一性作用于各种动物膜通道及受体的多肽毒素。与其它生物活性物质相比，动物多肽毒素具有以下3个显著的特点：1)自然界亿万年的进化选择赋予动物多肽毒素具有高活力(作用通道和受体活性达到皮摩尔水平)和强专一性(有效区分膜通道和受体亚型)；2)在协同进化驱使下，动物多肽毒素广泛存在多拷贝基因家族和高进化速率，从而呈现惊人的分子水平生物多样性；3)差异的生态环境使不同地域的动物毒素具有功能和结构的特殊性。我国有丰富多样的有毒物种资源，迄今为止已发现芋螺百余种，蝎类30余种，蛇类200余种，两栖类400余种，蜘蛛有4000多种，昆虫数万种以及数量众多的其他有毒动物。在地域广阔和生态复杂的我国，动物多肽毒素的上述特点使它们早已成为国际竞争挖掘和利用的天然药物资源。近年来，新型动物多肽毒素的挖掘与利用在国际生命医学研究和创新药物开发中更为活跃。它们已成为解析生命现象必备的"分子探针与解密器"，推动了生命科学领域中最具有挑战性的诸如医学、免疫学、神经生物学、生理学等学科的蓬勃发展，成为新药作用靶点发现与确立的有力工具以及新药创制的优质先导分子。本文就动物多肽毒素研究的科学意义以及国内外该领域当前的研究热点作一简要综述。

1 开展动物多肽毒素研究的科学意义和应用价值

1.1 动物多肽毒素是解析膜通道及受体的结构与功能的分子探针

膜通道及受体的结构-功能研究是揭开人类疾病奥秘的关键，倍受科学界的关注。1952年，Alan Hodgkin等(1963年诺贝尔生理医学奖得主)证明了细胞膜上通道的存在，并记录到了膜通道贡献的动作电位信号；Jens Skou(1997年诺贝尔化学奖得主)发现了一类能从低浓度向高浓度跨细胞膜转运物质细胞膜钠-钾泵；Erwin Neher(1991年诺贝尔生理医学奖得主)发明了膜片钳技术，解决了细胞膜电流的测定问题；MacKinnon等在前人研究成果的基础之上首次成功地测定了一种钾通道膜蛋白的空间结构，验证了钾通道的组装、结构-功能关系的共性问题[1]，因此摘得了2003年的诺贝尔化学奖。然而，膜通道的结构组装、生物活性物质跨膜运动、膜通道门控信息的整合调控等一系列重大基础问题仍未解决。

动物多肽毒素作为研究这一重要基础科学问题的"生物分子探针或钥匙"，对揭示膜通道及受体蛋白的结构特征、功能机制等研究做出了极其重要、不可替代的贡献。例如，蜘蛛毒素Hanatoxin－I作为电压门控钾通道的调制剂，对于揭示Kv2.1钾通道电压敏感元件的构象及门控调节机制起到非常重要的作用，已成为研究钾通道必不可少的工具分子[2,3]。类似的范例还有 -银环蛇毒素与胆碱能受体、长链 -蝎多肽毒素与电压门控钠通道、非洲曼巴蛇Dendrotoxin与Kv1.1钾通道、蜂毒明肽与小电导钙激活钾通道 (SKCa)、芋螺毒素ω－GVIA和MVIIA与N－型电压门控钙通道等等。这些成果推动着医学、神经生物学、生理学、药理学等众多现代生命科学不断发展、知识不断更新

1.2 动物多肽毒素是探究某些重大疾病发病机制的分子工具

动物多肽毒素也是探究重大疾病发病机制的重要分子工具。如蝎毒液中Chlorotoxin多肽毒素可特异性结合肿瘤组织，它通过与金属基质蛋白酶MMP-2和细胞膜上氯通道发生复杂的相互作用，有效地抑制神经胶质瘤细胞上的氯电流[4]。由于Chlorotoxin多肽毒素具有特异性结合肿瘤组织的特性，其作为分子探针在肿瘤疾病发生机制方面的研究十分活跃[5,6]。又比如，离子通道与痛觉的传递有着复杂的关系，以前人们并不清楚N-型钙离子通道与疼痛相关，正是由于发现芋螺毒素Conotoxin-MVIIA，一种N-型钙离子通道的抑制剂，具有很好的镇痛效果，从而明确了神经突触前膜的N-型钙离子通道是与疼痛相关的重要离子通道。

当前，动物多肽毒素与膜通道及受体相互作用，导致膜通道蛋白分子器件的结构动态变化又成了一个全新的研究热点[7]。不同有毒动物分泌的不同多肽毒素作用于多样的膜通道及受体(如钠、钾、钙、氯、TRP等膜通道)，机制极其复杂，即使选择性地作用于同一类膜通道，其调制机理也可能是多样的[8]。动物多肽毒素与相关膜通道及受体的关系，犹如"矛与盾"，相互统一，相互依赖，相互适应。解析其中奥秘恰是当今全球相关科学家们实施全新药物战略目标的关注焦点。。

1.3 动物多肽毒素是创新药物的源泉

我国传统医药常用"以毒攻毒"的策略治疗人类的疑难杂症，有毒动物，如蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等是首选。当今，靶特异性动物多肽毒素已成为全球化研发/治疗相关疾病重要药物的资源[9]。例如，来源于蜥蜴毒素的 Exenatide,特异作用于GLP-1受体，已于2005年4月被美国FDA批准用于II型糖尿病治疗；具有镇痛作用的ω-芋螺毒素Ziconotide，为N-型电压门控钙通道阻滞剂，于2004年12月28日被美国FDA正式批准为鞘内注射治疗疼痛的新药(商品名为Prialt)。目前临床上多种广泛应用的多肽类心血管药物也来源于动物多肽毒素，如临床上首个成功的血管紧张素转化酶抑制剂captopril，是从毒素舒缓激肽增强肽结构发展而来的；美国默克公司于1998年向市场推出了以非洲曼巴蛇毒素为分子模板研"Agrastant"新药，可使心绞痛发生率减少三分之一；目前正开展临床II期实验的蜘蛛多肽毒素GsMTx4，专一性抑制机械门控阳离子通道，极有可能成为治疗心律失常最好药物[10]；从叶蛙属(Phyllomedusa)皮肤中获得的有麻醉作用的蛙啡肽，镇痛作用是吗啡的2000倍,且无药物耐受性和成瘾性，已进入三期临床实验。我国在动物多肽毒素药物研发中也取得了许多重要的成果。中科院昆明动物所研究人员以眼镜蛇多肽神经毒cobra toxin研制的用于镇痛的国家新药"克洛曲"已广泛用于临床，该药具有镇痛效果强，药效时间长，成瘾性小的特点。湖南师范大学与北京大学未名生物工程公司合作研究的N-型钙通道抑制剂HWAP-I作为具有很强镇痛作用的国家一类新药，已完成临床前研究，获得进入临床试验批文。军事医学科学院从芋螺中发现的专一作用于N型 钙通道抑制剂SO-3，镇痛活性高于临床药物MVIIA，目前即将完成临床前试验。上海大学相关实验室针对东亚钳蝎多肽毒素的系统动物疼痛或镇痛行为学模型研究，表明我国蝎毒中含有多种致痛/镇痛或癫痫/抗癫痫的膜钠或钾通道型活性成份。上海大学和美国洛杉矶锡达－西奈医学中心最近发现蝎多肽毒素可有效地抑制肿瘤的生长[11,12]。此外，上海大学发现的专利多肽产品martentoxin、美国加利福利亚大学在研的海葵多肽毒素ShK、法国国家科学研究中心研究的蝎毒素OSK1多肽有望成为阻断钾通道(BKCa、Kv1.3和IKCa)的新型多肽药物[13,14]。可见，正是这些多肽毒素特异作用于膜通道及受体，才具有良好的应用效果和广阔的临床应用前景。

近期完成的人类基因组计划资料显示，编码膜通道分子器件基因约有350个。由于这些膜通道担负着重要的生理功能如神经和肌肉兴奋性的调节、激素分泌、细胞增殖、感觉信号传导、学习和记忆、血压调节、受精和细胞死亡等，因此，通道的基因缺失、突变或功能性失调会导致一系列疾病发生，如高血压、糖尿病、神经胶质瘤等[15,16]。世界卫生组织于2007年3月27日公布全世界约有10亿人口受膜通道相关神经障碍的折磨，造成巨大损失。由于膜通道的变化与人类疾病密切相关，因此，随着研究的不断深入，全球高度关注约350个膜通道亚型在生理和病理中的作用，使人类对膜通道相关疾病的病因、预防和治疗有了新的认识。例如，钾通道hERG已成为筛选可能引起长QT综合症副作用的关键膜通道靶标[17]，这一重大成果直接发现了临床上广为使用药物，如MK-499,cisapride,terfenadine等，不但不能治疗疾病，而是导致病人死亡的"杀手"，这些药物已被禁用。另外，钾通道Kv1.3已成为新型免疫抑制调制剂的靶标蛋白[18,19]，药用前景十分可观。因此，随着越来越多的膜通道被鉴定为多肽毒素新药的靶标蛋白，充分认识和挖掘我国动物多肽毒素资源，系统深入地开展疾病相关膜通道靶向多肽毒素新药研究，意义重大。

2 当前动物多肽毒素的的研究热点

2.1 动物多肽毒素分子多样性与结构特征

为挖掘和认识自然界的动物多肽毒素资源，国内外众多实验室都开展了多肽毒素的生化分离和基因克隆筛选。法国国家科学研究中心率先在世界上开展蝎多肽毒素库的构建工作，并将动物多肽毒素商品化(http://www.latoxan.com/)。以色列也成立了相应的动物多肽毒素-膜通道阻断剂和激动剂的专营公司(http://www.alomone.com/)。墨西哥的学者在全球范围内搜集有毒动物，并利用直接分离纯化-质谱法和构建基因库方法，大规模地开展动物多肽毒素库的工作[20]。

我国是世界上有毒动物资源最丰富的国家之一，国内科研人员在国家有限资金投入下，努力地开展了蜘蛛、蝎、蛙、芋螺、蜂等有毒物种毒腺c-DNA文库与多肽毒素分子多样性的研究，缩短了与国外水平的差距。湖南师范大学研究人员对我国海南捕鸟蛛和虎纹捕鸟蛛的毒液多肽组学进行了研究，建立了目前单一蜘蛛物种多肽序列最多的数据库，取得国际领先的研究成果[21,22]；上海大学相关实验室研究并原创性命名了我国东亚钳蝎长链神经多肽毒素，即电压门控钠通道调制剂达10余个[23,24]；武汉大学相关研究组从我国东亚钳蝎中除发现了约80个膜通道亚型调制剂外，还首次发现了一类新的无二硫键的蝎毒素基因家族[25,26]和一类新的短链钾通道蝎毒素基因亚家族α-KTx14；中科院昆明动物所研究人员通过对牛虻多肽组学的研究，首次揭示该昆虫吸血过程抗凝血的分子机制，得到国际同行高度评价[27]。

与此同时，我国相关研究单位在挖掘动物多肽毒素(同一物种间和不同物种间)的海量信息中蕴藏的自然奥秘方面,也取得了世界领先的很好的研究成果。武汉大学在国际上首次提出以RNA监视和反式剪接为基础的蝎多肽毒素基因表达调控机制方面的新假说[28]。

2.2 动物多肽毒素与通道及受体的选择性及其相互作用机制

有毒动物针对其猎杀对象经过亿万年协同进化产生多种多样选择性不同的多肽毒素，以作用于猎物神经系统及其他生理系统细胞膜上各种通道和受体蛋白继而导致猎物麻痹或致死。针对动物多肽毒素-膜通道及受体相互作用的选择性及其分子机制，我国相关科研人员在以下4个方面取得重要的研究成果，并将在已有的研究基础上开展深入研究：(1)动物多肽毒素药理学活性的规模化鉴定：(2)动物多肽毒素的通道调制机理研究：(3)动物多肽毒素-膜通道及受体相互作用结构信息学研究；(4)动物多肽毒素作用的新型靶蛋白及其信号通路：

2.3 动物多肽毒素的应用开发研究

高选择性的动物多肽毒素不仅可成为膜通道及受体鉴定的"多肽毒素探针"，而且是治疗相关的疾病的潜在药物[29]。现约40余个动物多肽毒素已商品化，且国际市场价格极其昂贵。至少10个动物多肽毒素已被研发成新药，广泛的应用于临床。超过30种动物多肽毒素处于临床前或临床试验阶段。虽然我国动物多肽毒素相关应用研究起步较晚，但发展势头强劲。军事医学科学院从芋螺中发现的专一作用于N型 钙通道抑制剂SO-3，镇痛活性高于临床药物MVIIA，目前即将完成临床前试验。上海大学相关课题组系统地研究了我国多肽毒素钠通道调制剂对伤害性感受与癫痫发作的整体与离体调制作用及其细胞与分子机制，发现它们可选择性调控初级感觉神经元上不同亚型的钠通道，改变神经元兴奋性，影响炎症过程的中枢敏化环节，进而在整体行为学上表现出致/抗伤害性作用或致/抗癫痫发作[30,31]；武汉大学也证明我国钠通道多肽毒素BmKIM对抗大鼠心律失常和癫痫有一定的调制作用[32]，已获批了两项专利。由科学院昆明动物研究所为主研发的一类新药"注射用尖吻蝮蛇凝血酶"获得国家药品监督管理局批准进入III期临床研究，该药与瑞典进口的止血药"立止血"比较，其有效剂量范围更宽，使用更安全可靠。昆明动物研究所从两栖类与昆虫毒腺中分离到环状小肽BA、牛虻免疫调节肽和胰岛素分泌促进肽等活性多肽，具有较好的研发抗炎和治疗II型糖尿病药物的前景，现正开展临床前试验。湖南师范大学研究组从我国虎纹捕鸟蛛毒素中分离鉴定出有很强镇痛活性的虎纹镇痛肽HWAP-I，获得了其结构和应用国内与国际专利。现已与北大未名集团合作完成了临床前实验，并获得了进入临床试验批件。中科院昆明动物所研究人员以眼镜蛇多肽神经毒cobra toxin研制的主要用于镇痛的国家三类新药"克洛曲"获国家新药证书并投入生产，该药的特点在于镇痛效果强，药效时间长，成瘾性小；该药已广泛用于临床，年产值超过亿元。

总之，动物多肽毒素在基础科学研究、新型生物产业、创新药物研发中具有独特和不可替代的作用。充分挖掘、保护、认识和利用我国特有动物多肽毒素自然资源，利用动物多肽毒素解析膜通道及受体结构－功能，探究人类重大疾病发病机制，发现药物作用新靶点，研制创新药物，有着重要科学意义和应用前景。

[1]Doyle DA,Morais Cabral J,Pfuetzner RA,et al.The structure of the potassium channel:molecular basis of K+conduction and selectivity[J].Science,1998,280(5360):69-77.

[2]Lee HC,Wang JM,Swartz KJ.Interaction between extracellular Hanatoxin and the resting conformation of the voltage-sensor paddle in Kv channels[J].Neuron,2003,40(3): 527-536.

[3]Phillips LR,Milescu M,Li-Smerin Y,et al.Voltage-sensor activation with a tarantula toxin as cargo[J].Nature, 2005,436(7052):857-860.

[4]Deshane J,Garner CC,Sontheimer H.Chlorotoxin inhibits glioma cell invasion via matrix metalloproteinase-2 [J]J Bio Chem,2003,278(6):4135-4144.

[5]Shen S,Khazaeli MB,Gillespie GY,et al.Radiation dosimetry of 131I-chlorotoxin for targeted radiotherapy in glioma-bearing mice [J].J Neurooncol,2005,71(2):113-119.

[6]Mamelak AN,Rosenfeld S,Bucholz R,et al.Phase I single-dose study of intracavitary-administered iodine-131-TM-601 in adults with recurrent high-grade glioma[J].J Clin Oncol,2006,24(22):3644-3650.

[7]Lange A,Giller K,Hornig S,et al.Toxin-induced conformational changes in a potassium channel revealed by solid-state NMR[J].Nature.2006;440(7086):959-962.

[8]Phillips LR,Milescu M,Li-Smerin Y,et al.Voltage-sensor activation with a tarantula toxin as cargo[J].Nature, 2005,436(7052):857-860.

[9]Zambrowicz BP,Sands AT.Knockouts model the 100 bestselling drugs--will they model the next 100 [J].Nat Rev Drug Discov,2003,2(1):38-51.

[10]Suchyna TM,Tape SE,Koeppe RE,et al.Bilayer-dependent inhibition of mechanosensitive channels by neuroactive peptide enantiomers[J].Nature.2004,430(6996):235-240.

[11]Bugalho P,Chorao M,Fontoura P.Miliary brain metastases from primary gastric small cell carcinoma:illustrating the seed and soil hypothesis[J].J Neurooncol,2005,73 (1):53-56.

[12]Mamelak AN,Rosenfeld S,Bucholz R,et al.Phase I single-dose study of intracavitary-administered iodine-131-TM-601 in adults with recurrent high-grade glioma [J].J Clin Oncol,2006,24(22):3644-3650.

[13]Ji YH,Wang WX,Ye JG,et al.Martentoxin,a novel K+-channel-blocking peptide:purification,cDNA and genomic cloning,and electrophysiological and pharmacological characterization.[J].J Neurochem.,2003,84(2): 3253-35.

[14]Beeton C,Pennington MW,Wulff H,et al.Targeting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channels for therapy of autoimmune diseases[J].Mol Pharmacol,2005,67(4):1369-1381.

[15]AshcroftFM.From molecule to malady[J].Nature, 2006,440(7083):440-447.

[16]Sokolov S,Scheuer T,Catterall WA.Gating pore current in an inherited ion channelopathy[J].Nature,2007,446 (7131):76-78.

[17]Sanguinetti MC,Tristani-Firouzi M.hERG potassium channels and cardiac arrhythmia [J].Nature,2006,440 (7083):463-469.

[18]Chandy KG,Wulff H,Beeton C,et al.K+channels as targets for specific immunomodulation[J].Trends Pharmacol Sci,2004,25(5):280-289.

[19]Beeton C,Wulff H,Standifer NE,et al.Kv1.3 channels are a therapeutic target for T cell-mediated autoimmune diseases [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(46): 17414-17419.

[20]Batista CV,D'Suze G,Gomez-Lagunas F,et al.Proteomic analysis of Tityus discrepans scorpion venom and amino acid sequence of novel toxins[J].Proteomics,2006,6(12): 3718-3727.

[21]Tang X,Zhang Y,Hu W,et al.Molecular diversification of peptide toxins from the tarantula Haplopelma hainanum (Ornithoctonus hainana)venom based on transcriptomic, peptidomic,and genomic analyses[J].J Proteome Res, 2010,9(5):2550-2564.

[22]Yuan C,Jin Q,Tang X,et al.Proteomic and peptidomic characterization of the venom from the Chinese bird spider,Ornithoctonus huwena Wang [J].J Proteome Res, 2007,6(7):2792-2801.

[23]Ji YH,Mansuelle P,Terakawa S,et al.Two neurotoxins (BmK I and BmK II)from the venom of the scorpion Buthus martensi Karsch:purification,amino acid sequences and assessment of specific activity[J].Toxicon, 1996,34(9):987-1001.

[24]Chai ZF,Zhu MM,Bai ZT,et al.Chinese-scorpion (Buthus martensi Karsch)toxin BmK alphaIV,a novel modulator of sodium channels:from genomic organization to functional analysis[J].Biochem J,2006,399(3):445-453.

[25]Zeng XC,Wang SX,Zhu Y,et al.Identification and functional characterization of novel scorpion venom peptides with no disulfide bridge from Buthus martensii Karsch[J].Peptides,2004,25(2):143-150.

[26]Zeng XC,Li WX,Peng F,et al.Cloning and characterization of a novel cDNA sequence encoding the precursor of a novel venom peptide (BmKbpp)related toa bradykinin-potentiating peptide from Chinese scorpion Buthus martensii Karsch[J].IUBMB life,2000,49(3):207-210.

[27]Xu X,Yang H,Ma D,et al.Toward an understanding of the molecular mechanism for successful blood feeding by coupling proteomics analysis with pharmacological testing of horsefly salivary glands [J].Mol Cell Proteomics, 2008,7(3):582-590.

[28]Zhu S,Li W,Cao Z.A naturally occurring non-coding fusion transcript derived from scorpion venom gland:implication for the regulation of scorpion toxin gene expression[J].FEBS lett,2001,508(2):241-244.

[29]Zambrowicz BP,Sands AT.Knockouts model the 100 best-selling drugs--will they model the next 100 [J].Nat Rev Drug Discov,2003,2(1):38-51.

[30]Tan ZY,Mao X,Xiao H,et al.Buthus martensi Karsch agonist of skeletal-muscle RyR-1,a scorpion active polypeptide:antinociceptive effect on rat peripheral nervous system and spinal cord,and inhibition of voltagegated Na(+)currents in dorsal root ganglion neurons[J].Neurosci lett,2001,297(2):65-68.

[31]Bai ZT,Liu T,Chai ZF,et al.Rat pain-related responses induced by experimental scorpion BmK sting [J].Eur J Pharmacol,2006,552(1-3):67-77.

[32]Peng F,Zeng XC,He XH,et al.Molecular cloning and functional expression of a gene encoding an antiarrhythmia peptide derived from the scorpion toxin [J].Eur J Biochem,2002,269(18):4468-475.