块菌主要生理活性及活性物质生产的研究进展

过 敏，唐丽薇，严金平，伊日布斯

(昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明 650500)

块菌主要生理活性及活性物质生产的研究进展

过 敏，唐丽薇，严金平，伊日布斯*

(昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明 650500)

块菌是一种与高等植物根部共生的地下真菌，生物分类学上属于子囊菌亚门、块菌目、块菌科、块菌属。块菌具有多种生理活性，包括抗氧化、抗病原微生物、保肝、抗诱变、抗肿瘤、调节女性月经周期和性功能等。该文较详细地介绍了块菌生理活性及获得活性物质的研究现状，并对目前块菌活性物质研究中存在的问题和发展前景进行了讨论和展望。

块菌，生理活性，活性物质

目前已被鉴定的块菌有数百品种［1］。黑孢块菌(T.Melanosporum)和白块菌(T.magnatum)在欧洲(法国，西班牙，意大利和希腊)被誉为“上帝的食物”和“厨房里的黑钻石”，售价昂贵，具有很高的经济价值。其中黑孢块菌多产于法国佩里戈尔地区，故又称为佩里戈尔黑松露(Périgord black)。白块菌，通常产于意大利北部，皮尔蒙特地区［2－3］。在我国，块菌主要分布在西南地区的四川、云南和西藏等地，其中云南产的印度块菌(T.indicum)和四川产的中国块菌(T.sinense)在外形上与黑孢块菌相似，其作为食用块菌的品质亦可相媲美［4］。目前研究较多的块菌包括黑孢块菌(T.melanosporum)、冬块菌(Tuber brumale)、夏块菌(Tuber aestivum)、印度块菌(Tuber indicum)、白块菌(T.magnatum)、勃氏块菌(Tuber borchii)、Tirmania nivea和Terfezia。其中后两者通常被称为沙漠块菌，是地中海沙漠及半沙漠地区特有的品种［2－3］。

在欧洲，块菌与鱼子酱、鹅肝酱被称为三大珍品，由于其独特的芳香，深受欧洲人的喜爱，块菌作为一种名贵的食用菌可以做成各种食品。根据品种的不同，国际市场上每公斤块菌的售价可以达到600～60003。

块菌含有丰富的营养物质，Singer R等［5］的研究表明，块菌的蛋白质含量普遍比其它食用真菌要高。Saltarelli等［6］测定了四种新鲜块菌(T.melanosporum，T.aestivum，T.magnatum，T.borchii)的蛋白质，其含量范围在8.7%～24%(干重)之间，其中色氨酸，蛋氨酸和赖氨酸的含量最为丰富。另外块菌中含有多种矿物质如Si、K、Na、Ca、Mg、Mn、Fe、Al、P、S、Cu和Zn。常明昌等［7］对块菌的铁、锌含量进行测定，结果显示其含量是一般水果的8～10倍。

块菌不仅含有丰富的营养成分，有关其生理活性方面的研究也引人关注。

1 块菌的生理活性

1.1 抗病原微生物活性

块菌的抗病原性是研究最多的生理活性，块菌提取物对革兰氏阳性、阴性的病原菌均有抑制作用。研究表明块菌Terfezia和Tirmania pinoyi的提取物对革兰氏阳性菌包括枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抗菌活性［8－9］。T.Claveryi提取物对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌具有明显的抗菌活性。因提取溶剂的不同块菌提取物的抗菌活性也有所不同。Hussan等［8］的研究表明，Tirmania块菌的甲醇提取物相对于乙醇，水和乙酸乙酯提取物，具有更高的抗菌活性。Terfezia块菌的乙醇提取物对于革兰氏阳性菌和阴性菌具有广泛的抗性。Janakat等［10－11］研究T.Claveryi的水和甲醇提取物的抗菌活性，结果显示，5%水提取物的抑菌效率最高，能抑制66.4%的金黄色葡萄球菌生长;同时还发现T.Claveryi的5%水提取物可以抑制铜绿假单胞菌，抑制率为40.9%，然而甲醇提取物却没有抑制作用。说明块菌中具有不同活性的抗菌活性物质成分。

1.2 抗氧化活性

活性氧与人体衰老、肿瘤、突变、炎症、心脑缺血、动脉粥样硬化、帕金森病等许多病理生理现象具有密切关系。研究发现在病理条件下，机体的抗氧化酶活性明显下降，清除氧自由基的能力减弱，导致氧自由基增多，损伤作用加重，因此抗氧化食品的研究与开发具有重要的现实意义［12］。

多种块菌不仅具有抗氧化能力，且其活性均比其它食用菌高［13］。Murcia等［14］对脂质过氧化作用、脱氧核糖和过氧化物酶分析实验的结果表明，块菌T.claveryi Chatin和P.juniperi Vittadini比一些常用的抗氧化剂:α－维生素E，丁基羟基茴香醚(BHA)，2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚(BHT)和没食子酸丙酯，具有更高的抗氧化活性，但是经过冰冻和罐装会导致新鲜块菌的抗氧化能力下降。罗强等［15］从印度块菌(Tuber indicum)子实体中提取出粗水溶性印度块菌多糖(Tuber indicum polysaccharide，TIP)，之后成功的用DEAE52纤维素和Sephadex G－100柱层析进行分离纯化，提取出两种主要的多糖组分:TIP1－1和TIP2－1。TIP1－1和TIP2－1具有相当强的抗氧化活性。TIP2－1对过氧化氢(300mmol/L)诱导的PC12细胞损伤有较好的抑制力，并且对自由基具有较强的清除能力。

在另一项研究中，Al－Laith［16］研究了分别来自于巴林岛、伊朗、摩洛哥、沙特阿拉伯的四种沙漠块菌的抗氧化能力。并对铁还原能力(Ferric reducing ability，FRAP)、2，2－二 苯 基 －1－苦 肼 基(2，2－diphenyl－1－picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力、抑制脱氧核糖损伤能力与一氧化氮(NO)自由基清除能力这四种抗氧化能力进行了检测。结果显示伊朗块菌具有最高的DPPH(36.6%±13%)，最强的NO自由基清除能力(EC50=102mg/mL)，最高的脱氧核糖破裂抑制比例(91%)。巴林岛和沙特阿拉伯块菌显示出最高的 FRAP值(分别为 18.62、18.06mmol/100g)。每100g以上块菌中维生素C、胡萝卜素、酯化多酚、自由和非黄酮多酚、黄酮含量的平均值分别为(681±245)、(10±51)、(1860± 361)、(1328±167)、(1034±124)、(293±32)mg。在所有样品中，巴林岛块菌的维生素C含量最高，伊朗块菌的胡萝卜素含量最高，巴林岛和沙特阿拉伯块菌的自由多酚含量最高，沙特阿拉伯块菌的花青素含量最高(23.6mg/100g)，可能是这些化学物质使得块菌具有抗菌活性。

Janakat等［17］研究了来自伊拉克巴格达的沙漠块菌(T.claveryi)的保肝作用，用白鼠做实验，测定不同T.Claveryi溶剂提取物(水，甲醇，石油醚)对于肝毒素CCl4的抵抗能力。在这项实验中，首先分别用不同的T.Claveryi溶剂提取物喂养白鼠，之后用肝毒素(CCl4和橄榄油混合物)进行腹腔注射。结果显示，T.Claveryi的水提取物具有最好的保肝性，其它两种溶剂(甲醇，石油醚)提取物也具有不同程度的保肝性。肝毒素CCl4能够引发机体产生自由基代谢絮乱，从而引起脂质过氧化物积累等一系列反应，进而促使肝细胞的凋亡或者直接死亡。块菌中含有丰富的抗氧化成分，例如维生素A、C、β－胡罗卜素和酚类化合物等，能够强烈清除自由基，从而抵抗CCl4对肝造成的损伤。

1.3 抗诱变活性

Hannan等［18］研究了Tirmania pinoyi的三种溶剂(水、三氯甲烷、乙醇)提取物的抗诱变能力，结果表明，Tirmania pinoyi的乙醇提取物能够抑制苯并芘对沙门氏菌TA98和TA100产生的诱变。

Fratianni等［19］研究了产自意大利的黑色块菌T.aestivum的抗诱变能力，这个团队通过艾姆斯氏实验来研究新鲜及经过辐射处理(60Coγ射线，辐射剂量为1.5kGy)的T.Aestivum的潜在抗诱变能力。他们发现无论是新鲜的块菌还是经过辐射的块菌，它们的水提取物和乙醇提取物都提高了细菌的抗诱变能力。相对于经过辐射的块菌，新鲜块菌的水提取物对沙门氏菌TA98的诱变抑制能力更强。而块菌无论是否经过辐射，其乙醇提取物抗诱变能力都要比水提取物低。结果表明T.aestivum可能含有能够抑制诱变产物形成的物质，但是相关抑制物质的分离鉴定及作用机制仍需进一步研究。

1.4 抗癌活性

胡惠娟等［20］研究了中国块菌多糖(polysaccharide of Tuber sinense，PST)对小鼠肿瘤及免疫系统的影响，实验结果表明PST(一种从中国块菌中提取出来的蛋白结合多糖)作为一种新的真菌多糖，毒性低，水溶性好，抑制肿瘤作用明显。

另外，Stanikunaite等［21］用包括块菌在内的22种来自北美的真菌，进行了生理活性的研究。这些真菌除具有不同程度的抗痢疾、抗结核、抗炎症的抗病原微生物的活性外，还具有抗氧化活性、抗癌活性。其中G.clausa和R.subgelatinosus两种块菌表现出明显的抗癌活性。

1.5 调节女性月经周期和性功能

人们通常用母猪或者经过训练的狗来寻找地下块菌。1981年，Claus等［22］从黑松露中鉴定出一种甾族激素——α－雄烷醇，因其具有独特的麝香气味，从而推断正是块菌中的这种物质可以吸引母猪。α－雄烷醇早在1951年就从女性的尿液中检测出来，其香味浓厚，并具有一定的催欲作用［23］。α－雄烷醇也在男性的腋下汗液中检测出来，但是缺乏雄性激素活性。用放射免疫检定法和气质联谱检测新鲜块菌中α－雄烷醇的含量，测定结果显示每克新鲜块菌含有40～60ngα－雄烷醇［21］。研究表明α－雄烷醇具有调节女性月经周期、引起女性兴奋的功能。α－雄烷醇很容易被氧化成雄烯酮类物质，从而使女性对男性产生负面的心理影响［24］。虽然α－雄烷醇是否具有类似于性激素作用还不能完全确定，但法国人已把该化合物加到男性香水中，且价格十分昂贵［25］。我国也有一些酒厂将新鲜块菌切片，泡制含有α－雄烷醇的保健酒，广受社会好评。

2 块菌活性物质生产的研究进展

块菌由于其独特的芳香和生理活性，备受美食界和国际社会的青睐，块菌在我国云南、贵州、四川等地产量丰富，当地人多以块菌为材料进行泡酒、烹饪、晒干磨碎(作为佐料或药材)。但由于生态环境的恶化和对于野生块菌资源的大肆开采，野生块菌的产量从上个世纪急剧下降［26］。在1993年之前，四川省的会东块菌年产量超过20t，到2003年，年产量只有4～5t。Tuber.siense，T.himalayense和T.pseudoexcavatum已经被列为“濒临灭绝的真菌品种”［27］。野生块菌的生长条件要求严格，生长周期长，受气候条件影响大，且容易受虫害和人工采集损伤的影响，昂贵的价格、大量的市场需求和可观经济效益更是难以满足大规模生产的需求。目前块菌活性物质的提取主要以野生块菌的子实体为原材料，通过蒸馏萃取，超临界萃取，固相微萃取等方法进行。

2.1 半人工模拟栽培

早在200年前，法国就开始尝试块菌的人工培养，到了20世纪70年代，地中海地区的国家开始通过果园来进行块菌培养［28］。随着菌根技术的不断发展，人们将块菌的子实体经匀浆后制成孢子悬液，或者将块菌的菌丝体接种在橡树等幼苗根部，让其形成带有菌根的菌根化苗木，将这些幼苗在适合林地上栽种，几年之后这片林地中便可长出块菌。这种前期工作在人工条件下完成，后期在自然条件下完成的块菌生活史被称为半人工模拟栽培(Semiartificial simulate cultivation)［29］。我国台湾省在1996年左右成功栽培出“台湾块菌”。2002～2003年，台商与国内企业联合在贵州省创建的块菌果园用印度块菌子实体匀浆制成的孢子悬浮液接种马尾松(Pinus massoniana)、云南松(P.yunnanensis)、槲栎(Ouercus aliena)、青冈栎(Cyc/oba/anopsisg/auca)等7种无菌幼苗，2008年12月，该果园收获了国内首批半人工栽培的块菌［30］。昆明植物所刘培贵研究组成功地培育了国产印度块菌(Tuber indicum)和华山松(Pinus armandii)、板栗(Castanea mollissima)的菌根幼苗，并且将接种成功的菌根苗移栽至块菌种植园科技示范实验基地［31］。虽然近些年，半人工模拟栽培技术在不同国家都取得了一定的成功，但块菌产量依然供不应求。主要是由于半人工模拟栽培技术培育出的果园块菌子实体产量不稳定，易受杂菌污染，且生长周期较野生块菌并未缩短，一般需要6～9年，果园块菌的生长受多种因素的影响，包括土壤特性，如pH和营养成分［32］、湿度和灌溉［33］、宿主植物的生理条件［34］、顶棚的光线和密度［35］、气候条件［36］、物种竞争［37］、块菌子实体上的微生物和生长在块菌土表的植物［38－39］。这些复杂的因素相互影响造成了果园块菌子实体产量的不均一性。因此，若以块菌子实体为原料生产生理活性物质仍存在生产成本高和原料供应难等限制性因素。

2.2 菌丝体发酵法生产块菌活性物质

液体发酵法生产真菌有用代谢产物的优势在药用领域得到了充分的验证，它可以避免人工栽培过程中气候、土壤、虫害、人为等条件的影响。同时发酵培养具有可以通过筛选获得高产菌种、容易控制培养条件、保证产物品质、易于大规模生产等优点。许多研究结果表明，很多高等真菌液体发酵的菌丝体多糖含量远高于人工栽培的高等真菌。据报道，从液体发酵蜜环菌菌丝体中所提取的粗多糖约为人工栽培的10倍［40］。对灵芝发酵的研究也有类似的报道，灵芝中的主要生理活性物质为灵芝酸和灵芝多糖，凌庆枝等通过优化条件，胞外灵芝酸产量达到0.86g/L，比自然发酵工艺提高了34.4%;并提高了胞内灵芝酸的产量，达到0.3649g/kg湿菌体［41］。

我国已经有一些研究者开始利用块菌菌丝体进行液体发酵生产活性物质，并取得了进展，汤亚杰等［42］通过块菌菌丝体深层发酵生产α－雄烷醇、块菌多糖等生理活性物质，测定每1mL发酵液中α－雄烷醇含量相当于2g新鲜块菌中α－雄烷醇的含量;还对接种量、碳源以及它们的初始浓度对于菌丝体生长和块菌多糖产量的影响进行了研究，结果表明蔗糖最适合细胞生长及胞内多糖(IPS)生产，乳糖最适合胞外多糖(EPS)生产。当蔗糖浓度为125g/L时，生物量和EPS产量都达到了最高值，分别为(24.07± 1.94)g/L和(2.85±0.04)g/L;蔗糖浓度为80g/L时，IPS产量最高，为(2.92±0.20)g/L。最大的EPS在接种量最大653mg DW/L时获得，为(1.97±0.08)g/L;最大的IPS为(1.40±0.10)g/L，在接种量为487mg DW/L时获得［43］。在另一项研究中，汤亚杰通过建立响应面模型研究氮源对块菌细胞生长和块菌多糖产量的影响，根据模型预测，葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨的最优初始浓度分别为60、30、10g/L，验证实验表明实验值与预测值相符合［44］;最后又进行连续发酵块菌生产菌丝体和块菌多糖，最大生物量、EPS和IPS的产量分别达到了(53.72±2.57)g DW/L，(7.09±0.62)g/L和(4.43±0.21)g/L［45］。这些研究表明，利用液体发酵生产块菌活性物质，具有成本低、易培养、周期短等优势，弥补了利用子实体生产块菌活性物质的不足，具有代替子实体用于生理活性物质工业化生产的潜力。

3 结论

目前对于块菌的研究多集中在真菌学、人工栽培和芳香成分分析等方面，并且由于块菌生长周期长、来源稀少，使得块菌生理活性物质的开发具有很大的局限性。近几年，液体发酵技术在块菌上的运用，为块菌生理活性物质生成提供了一种更为高效率，低成本的方法。虽然块菌通过不同溶剂提取的提取物生理活性得到了研究，但块菌溶剂提取物中具有生理活性的单独或复合成分仍未分离鉴定，活性物质的具体化学组分研究存在不足。另外，不同块菌的生物活性物质的种类及含量具有差异，有针对性的筛选适合生产特定活性物质的块菌具有重要意义。

最近，黑孢块菌的全基因组的测序已完成［46］，这也使得研究者们能够从基因水平深入研究块菌的生理活性，对块菌特定活性物质的合成途径和主要功能基因进行解析。利用微生物代谢工程的原理，可以有针对性地对块菌菌丝体进行代谢工程改造，高效生产α－雄烷醇、块菌多糖等生理活性物质。

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Main physiological activities of Truffles and research progress of active substances production

GUO Min，TANG Li－wei，YAN Jin－ping，CHAGAN Irbis*
(Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China)

Truffles belong to a family of fungi that grow underground in a symbiotic relationship with the higher plants.In taxonomy，they belong to tuber，tuberaceae，tuberales of ascomycetina.Truffles have a wide range of physiological activities，including oxidation resistance，anti－pathogenic microorganism activity，liver protection，resistance to mutagenesis，antitumor and regulation of menstrual cycle and sexual function in females，et al.In this review，the physiological activities of Truffles and research progress of obtaining active substances were introduced in detail.The problems existing in the current research of active substances in truffles were investigated and its development prospect was proposed.

Truffle;biological activity;active ingredient

TS201

A

1002－0306(2012)21－0403－05

2012－05－08 *通讯联系人

过敏(1986－)，男，硕士研究生，从事块菌的生理活性及活性物质生产研究。