3种不同甘蔗品种蔗蜡中多廿烷醇分离及其成分

黄清铧 ，黄俊生 ，黄冬婷 ，黎鹏 ，谢建伟，孟飞 *

1. 广东省科学院生物工程研究所（广州 510316）；2. 广东省生物材料工程技术研究中心（广州 510316）；3. 湖南科技学院化学与生物工程学院（永州 425199）

世界卫生组织（WHO）在《2018世界卫生统计报告》（World Health Statistics 2018）[1]中指出，非传染性疾病死亡人数约占总死亡人数的71%，其中心脑血管疾病排第一。中国心脑血管疾病患者已经超过2.7亿人，占中国每年总死亡病因的51%。血脂代谢紊乱是心脑血管疾病的主要原因[2]。临床应用的降胆固醇药主要为他汀类药物。然而，他汀类药物会对部分患者造成肝脏功能和骨骼肌损害，甚至有诱发骨骼肌溶解导致患者死亡的危险，此外还有可能导致血糖异常和诱导糖尿病的风险[3]。

多廿烷醇（Policosanol），是由多个长链脂肪族伯醇（C20～C36）组成的混合物[4]。据报道，该类化合物具有减少血小板聚集和内皮损伤，降低胆固醇、抗炎等多种生理活性[5-6]，特别是能有效降低高胆固醇血症患者的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量，并提高高密度脂蛋白胆固醇的含量，减少动脉粥样硬化和冠心病发病的危险，且安全性非常好。因此，多廿烷醇是一种预防和治疗高胆固醇血症和其它一些心血管疾病的安全有效药物。

多廿烷醇绝大部分是以脂肪酸酯的形态存在于蔗蜡、蜂蜡、糠蜡、小麦胚芽油、高粱、花生、向日葵籽仁、虫蜡等天然产物中，在一些食物的叶、果实和种子中也有广泛存在[7]。中国甘蔗种植面积大，品种多，蔗蜡资源丰富，是制备多廿烷醇的优质天然原料[8]。众所周知，甘蔗品种和产地的差异必然会导致蔗蜡成分的差异，从而使得多廿烷醇中各脂肪醇的组成和含量也有不同。蔗蜡多廿烷醇多数是从蔗渣和滤泥中获得[9]。然而，滤泥杂质多，糖分高，易发酵，导致部分蔗蜡分解，原料不易储存等；另外，增加有机溶剂使用量且部分杂质容易进入终端产品，会导致产品质量不稳定，从而很难应用到药品及保健品等高端领域。基于此，试验选取广东产地的3种不同品种的蔗蜡，从未收割的甘蔗上，直接收集表皮和茎上的蔗蜡，探讨其多廿烷醇的提取方法，并通过气相色谱（GC）对各样品中的脂肪醇种类和含量进行分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Perkin Elmer Claru S680气相色谱仪。

粗蔗蜡原料：在广东省翁源县甘蔗场，在未收割的甘蔗上，直接用砂纸现场刮取22、356和727这3种甘蔗品种的蜡质，存放于先前准备的样品袋中。将砂纸浸泡在无水乙醇中，将蔗蜡从砂纸上刷下，减压浓缩蒸去乙醇，烘箱中60 ℃下干燥4 h，得3种蔗蜡样品，分别命名为22号、356号和727号。

正二十六烷醇、正二十八烷醇、正三十烷醇、正三十二烷醇（均为分析纯，Adamas试剂公司）；其余化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 蔗蜡的精制

称取5 g粗蔗蜡，置于50 mL圆底烧瓶中，加入25 mL 95%乙醇，升温至90 ℃待粗蔗蜡完全溶解，并在此温度下保持回流1 h。静置冷却后溶液分层，倾倒出上层析出物，抽滤并用95%冷乙醇洗涤2～3次，收集固体于60 ℃下烘干6 h，得灰白色精制蔗蜡。

1.2.2 皂化和萃取

称取1 g精制蔗蜡，加入到圆底烧瓶中，加入15 mL无水乙醇和0.14 g NaOH，在90 ℃下搅拌回流4 h后至皂化结束。将反应液冷却至60 ℃时，向其中加入30 mL石油醚搅拌萃取40 min后，加入同体积的预先加热到60 ℃的蒸馏水，继续搅拌20 min。分出石油醚层，减压旋蒸去除石油醚，得多廿烷醇粗品。

1.2.3 粗醇的脱色和精制

取1 g粗醇置于50 mL圆底烧瓶中，加入30 mL无水乙醇后升温至80 ℃，待粗醇全部溶解后回流搅拌20 min。加入50 mg活性炭继续回流搅拌5 min脱色，趁热过滤，用70 ℃的热乙醇洗涤活性炭2～3次。母液浓缩至20 mL，缓慢冷却，析出白色固体，为精制多廿烷醇。

1.2.4 多廿烷醇的成分分析

1.2.4.1 气相色谱分析条件

FID火焰离子化检测器、HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm）毛细管柱、分流进样器温度280 ℃、气化室温度300 ℃、检测器温度300 ℃；程序升温：初始温度180 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至260 ℃，保持12 min；载气（N2）流速45.0 mL/min；氢气（H2）流速40.0 mL/min；助燃气（Air）流速450 mL/min；进样量5 μL；峰面积定量法。

1.2.4.2 标准溶液的配制

标准溶液：分别称取20 mg正二十六烷醇、20 mg正二十八烷醇、30 mg正三十烷醇和40 mg正三十二烷醇标样，分别加入到10 mL容量瓶中，用CHCl3溶解定容，制得2 mg/mL正二十六烷醇、2 mg/mL正二十八烷醇、3 mg/mL正三十烷醇和和4 mg/mL正三十二烷醇标准溶液；分别移取0.10，0.25，0.50，1.00和2.00 mL 4种烷醇标准溶液于10 mL容量瓶中，用CHCl3定容，配制混合标准溶液，浓度梯度见表1。

表1 混合标准溶液浓度梯度

1.2.4.3 3种多廿烷醇样品分析

将制得的3种多廿烷醇分别取样溶于CHCl3溶液，分别配制成500 μg/mL浓度，经GC检测3次，取其平均值。根据出峰时间、积分面积和标准曲线，确定其高级脂肪醇种类和含量。

1.2.5 多廿烷醇的成分分析

统计分析：所得结果以“平均值±标准差”表示。利用SPSS 20.0软件对数据进行方差分析（ANOVA），LSD，S-N-K和Tukey s-b检验等统计分析。

2 结果与讨论

2.1 3种蔗蜡精制产率

蔗蜡主要由蜡状类脂物及脂肪状类脂物组成，其中蜡状类脂物垂直立于甘蔗茎、节的表皮上；而脂肪状类脂物，则存在于甘蔗茎的内部，是植物细胞原生质的主要组成成分。在蜡状类脂物的收集过程中，一些机械杂质、灰尘泥土等也会进入样品，因此需要对其进行精制。首先将粗蔗蜡溶于乙醇，在回流温度下搅拌充分溶解，冷却析出，收集最上层蔗蜡，去除烧瓶最底部机械杂质、滤泥灰质及胶质等和中间层蔗脂。3种不同品种的蔗蜡精制产率如表2所示，22号蔗蜡产率最高，为83.7%，356号最低，从产率结果可以看出3个品种精制蔗蜡产率相差不大。精制后蔗蜡的外观由褐色变为灰白色。

表2 蔗蜡精制产率

2.2 蔗蜡的皂化、萃取和粗醇的脱色、精制

精制蔗蜡中主要为由长链一元脂肪醇与长链脂肪酸所形成的烷基酯。在皂化过程中，烷基酯水解得到相应的一元脂肪醇，即为多廿烷醇；而相应的脂肪酸则与过量的碱形成羧酸盐溶于乙醇-水溶剂中。皂化结束后，用石油醚萃取、浓缩，得多廿烷醇粗品，得率在42.5%～50.2%之间，其中22号得率最高。将粗品进行活性炭脱色和冷却结晶处理，得精制多廿烷醇，为白色固体，其得率在45.6%～50.3%之间，其中727号得率最高（表3）。

表3 多廿烷醇精制产率

2.3 精制多廿烷醇成分分析

2.3.1 各高级脂肪醇的混合标准曲线及色谱图

正二十六烷醇、正二十八烷醇、正三十烷醇和正三十二烷醇混合色谱图见图1。以各高级脂肪醇为横坐标，气相色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线（图2），得各烷醇回归方程：正二十六烷醇，y=4 403.1x-9 884.2，R2=0.999 9；正二十八烷醇，y=4 145.7x-5 516.5，R2=1；正三十烷醇，y=4 992.9x-14 040，R2=0.999 8，正三十二烷醇，y=5 132.1x-14 095，R2=0.999 7。

2.3.2 3种多廿烷醇样品分析结果

3种精制烷醇的色谱图如图3～图5所示，组成及含量分析如表4和表5所示。结果显示，3种精制烷醇中，均未检测到正三十二烷醇；3种精制烷醇样品中正二十六烷醇、正二十八烷醇和正三十烷醇总含量占样品质量比的80%以上，其中，356号比例最高，为89.18%±1.52%。三个品种精制烷醇中均含有少量三十烷醇，比例约4%；3种精制烷醇中正二十八烷醇和正三十烷醇含量较高，其中以正二十八烷醇为主要成分，22号和727号中正二十八烷醇和正三十烷醇含量相近（p＞0.05），356号中正二十六烷醇、正二十八烷醇和正三十烷醇最高，显著高于22号和727号（p＜0.05）。3种精制烷醇中正二十六烷醇、正二十八烷醇和正三十烷醇含量比值相近，约4∶16∶1。

图1 正二十六烷醇、正二十八烷醇、正三十烷醇、正三十二烷醇的混合物色谱图

图2 正二十六烷醇、正二十八烷醇、正三十烷醇、正三十二烷醇的混合物标准曲线

图3 22号多廿烷醇色谱分析图

图4 356号多廿烷醇色谱分析图

图5 727号多廿烷醇色谱分析图

表4 样品检测含量及比例

表5 方差分析

3 讨论与结论

从3种广东产的甘蔗品种（22、356和727号）的表皮和茎上，直接刮取其粗蔗蜡；以蔗蜡为原料，通过乙醇热回流、冷却，粗蔗蜡的各成分被冷却析出，去除机械杂质、滤泥灰质及胶质等成分，蔗蜡产率在79.7%～83.7%之间。蔗蜡通过皂化水解、萃取、脱色精制等步骤制得精制多廿烷醇，得率在45.6%～50.3%之间。陈赶林等[10-11]从广西上思糖厂甘蔗渣中提取4.20%～4.27%粗蜡，精蜡为2.38%左右；采用新鲜甘蔗表层蔗皮提取蔗蜡，得率为4.4%～4.6%。宋宁宁等[12]从滤泥中提取蔗蜡，以酯交换法从蔗蜡中提取高碳脂肪醇，其得率为16.75%～17.34%。侯宗福等以商品蔗蜡为原料，经过乙醇精制长链脂肪醇，其得率为24%。与甘蔗渣、滤泥、蔗皮及商品蔗蜡中提取高级脂肪醇相比，直接从甘蔗茎上刮取蔗蜡蔗，高级脂肪醇得率大大提高且操作简单，所需设备和流程不多。

采用GC分析方法对3种多廿烷醇中的高级脂肪醇的种类和含量进行定性和定量分析，结果表明，3种多廿烷醇组分及含量类似，均以具有最强生理活性的正二十八烷醇为主要组分，其含量在61.58%～66.87%之间，同时含有16.97%～18.22%二十六烷醇和3.83%～4.09%三十烷醇，各成分含量显著高于从蔗皮、蔗渣或滤泥中提取的各成分含量。

从甘蔗表皮和茎上，直接刮取其粗蔗蜡分离提取多廿烷醇，样品纯度高，提取工艺简单，这为多廿烷醇应用到药品及保健品等高端领域提供很好借鉴，也为甘蔗产业链的延长和高值化提供有益参考。