植物诱导抗病性的机理及诱导剂研究进展

李钠钾，时向东，马 啸，杨 超

(1.重庆烟草科学研究所，重庆 400715;2.河南农业大学烟草学院国家烟草栽培生理生化基地，郑州 450002;3.重庆市烟草公司烟叶分公司，重庆 400023)

自然界的植物在不断的进化过程中，为了适应环境的变化和许多病原物的侵袭，逐渐形成了一套抵御自然灾害的机制，其中包括一套类似动物的免疫系统，虽然科学界对植物是否存在与动物或人类相似的免疫系统一直未能达成共识，但是越来越多的研究表明，植物体内确实存在一套特有的免疫机制，已经被绝大多数科研人员所认同。

抗性植物的诱导抗病性(induced resistance，IR)是指植物在一定的生物或非生物因子的刺激作用下，通过激活植物的天然防御机制，产生一种后天免疫功能，使植物免受或减轻病原物侵染的危害［1］。诱导抗性可以在受侵染的部位局部表达，也可以在未受侵染部位系统性表达。

早在1933年，Chestwer等［2］病理学家发现用病菌侵染植物后，植物的防御反应被激活，被侵染叶片中释放出信号产物，并且被转移到植物其他部位而诱发防御反应。植物这种诱导抗病性开始得到广泛的关注。1955年，Kuc提出了“植物免疫”的概念:在外界因子作用下，植物能产生诱导抗性，从而抵抗病原菌入侵，抑制病原菌生长，使植物免遭病害或使病害减轻。他还发现用霜霉菌注射烟草叶片，经组织培养产生的新植株同样具有对霜霉菌的系统抗性，但是这种免疫作用并不能传到其所结的种子中［3］。Yarwood［4］也发现真菌能诱导植物产生免疫力。进入21世纪后，Jen Sheen等［5］发现了能使植物对病原菌产生抗性的途径，2006年，Jonathan等［6］进一步提出了植物免疫系统的概念。Shen等［7］于2007年指出，植物具有特殊的可以识别细菌、病毒和霉菌等微生物入侵的“免疫传感器”，同年，美国康奈尔大学的Klessig等［8］通过相关研究进而确定了植物免疫响应过程中一个关键的信号物质——水杨酸甲酯。

目前的研究认为，植物诱导抗病性主要分为两种类型:由病原菌等诱导产生的系统获得抗性(Systemic acquired resistance，SAR)和由非病原菌介导而产生的诱导系统抗性(Induced systemic resistance，ISR)［9］。系统获得抗性主要是通过植物抗病基因(R)与病原微生物的无毒基因(avr)相互识别和相互作用来实现的，在这个过程中，需要一系列的信号转导，目前的研究表明，SAR途径的信号物质是水杨酸(SA)，植物在病原菌侵袭后通过SA的积累，激活自身的免疫机制;而诱导性系统抗性是植物上的另一种诱导抗性，它最初被定义为根围细菌在叶片中引起的局部的或系统的抗性［10］。ISR所引导的是一种不依赖水杨酸积累与PR蛋白基因表达的系统抗性形式，其信号物质是茉莉酸(Jasmoic acid，JA)和乙烯(Ethylene，ET)［11］。而对于这类诱导，目前还没有建立起明显的生化标记，但是对荧光假单胞菌、烟草内生细菌等的筛选表明，ISR也能在植株上诱导广谱抗病性［12－13］。

一、系统性获得抗性(SAR)作用的机制

(一)信号的识别与转导

近年的研究认为，病原菌或者诱导物只有在被植物识别后，才会激活植物对病原菌的防御反应，相关防卫基因才会得到表达，这种识别物质即受体。普遍认为，这种受体存在于植物细胞膜上，而在细胞壁上则没有这样的结合位点。通过研究，人们已在大豆、小麦、大麦、水稻等植物中确定了相应的结合位点。Yoshikawa等［14］首次证明了病原菌能被植物表面的受体所识别，他们用同位素标记［14C］-mycolaminaran，发现它能与大豆细胞膜组分专一性地结合，并能诱导产生大豆素，进一步的研究表明，该结合位点具有高度的专化性。Schmidt［15］用［3H］和［135I］标记一种从豆疫霉中分离出的葡聚糖，发现它能与大豆细胞高度亲和性结合，标记物同膜的亲和度与其产生的诱导抗性呈相关。1991年，Choeng和Hahn则进一步证实了这一膜上的结合位点是蛋白或是糖蛋白［16］。

Belkhadir等［17］认为，植物的信号转导主要分为三个环节:第一，植物通过细胞外的LRR或TIR功能域识别外源信号，决定抗病的特异性;第二，通过NBS功能域内的蛋白质磷酸化作用转导外源信号;第三，通过细胞内的LRR等功能域传递磷酸化信号。磷酸化信号过程最终与防卫反应相偶联，导致植物出现抗病性反应。

(二)水杨酸通路及活性氧爆发

当外源诱导经过细胞信号转导起动防卫反应时，水杨酸的信号通路被首先激活，通过水杨酸的积累，可能抑制过氧化物酶或者抗坏血酸氧化酶的活性，使H2O2或者其他活性氧积累并爆发，在水杨酸转导的下游分支，某些含锚蛋白重复序列的蛋白或者蛋白激酶都可以激活防卫反应基因的表达，导致抗病性［18］。

大部分正常的植物细胞中都有活性氧(reactive oxygen species，ROS)的代谢和相应的调控机制，使其维持在一定的浓度范围内而不至于对细胞造成伤害。而一旦受到病原菌侵染，则会导致活性氧的大量积累［19，20］，主要包括超氧阴离子(·O2－)、氢氧自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)等。宋凤鸣等发现用病原物及其相关诱发物侵染植物，可以引起植物体内·O2－的积累［21］。Chong等的试验也表明，活性氧水平的增加与烟草的抗病性提高之间存在一定相关性［22］。

通过氧化激增，植物局部会出现程序性死亡而产生过敏反应(Hypersensitive Reaction，HR)。过敏反应是植物抗病的基本反应，可以诱导植物的主动防御机制，如氧爆发(oxidantive burst)、植保素和抗菌物质产生、防卫基因的启动及病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PRP)的表达，植物最终表现出局部获得抗性(local acquired resistance，LAR)和系统获得抗性(SAR)。人们普通认为，过敏反应不仅是一种抗病反应，也是一种诱导植物系统抗性的途径［18］。

(三)细胞结构增强

主要是指植物表面角质层和细胞壁组成的加强。对木质素的研究表明，植物染病后，细胞通过增加木质素的含量来加强细胞壁，增强组织木质化程度，提高细胞壁抗真菌穿透、抗酶溶解的能力，限制水和营养物向病菌转移，使其得不到足够的营养而阻止其生长和增殖，同时对病原物的扩散起到屏障的作用［23］。用稻瘟病菌中分离的糖蛋白激发子处理水稻，可以加速诱导非亲和性的互作水稻品种叶片木质素含量的增加［24］。

(四)抗菌化合物

这类物质包括酚、植保素、病原物酶的抑制剂等。酚类物质中有些是病原物的拮抗剂，能够抑制真菌抱子萌发和菌丝生长;有些则能抑制病原物毒素及酶的产生或者使其钝化。植保素是植物受到病原物侵染或胁迫时，体内合成的一类对病原物有一定毒性的低分子量的次生代谢产物，它常定位于侵染点处，能抵抗病原物的侵染和扩展［25］。

(五)病程相关蛋白(PRs)

20世纪70年代，在TMV侵染的烟草叶片中，病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PR)被首次发现。PR蛋白是植物在病理或病理相关的环境下诱导产生的一类可以直接攻击病原菌的蛋白。病原菌侵染后，会导致植物病程相关蛋白基因的表达［26］。Van Loon［10］对 PR 蛋白的分类提出了统一的命名法，到目前PR蛋白包括17个蛋白家族。其中PR－1、PR－2(β－1，3－葡聚糖酶)、PR－3(几丁质酶)、PR－4和PR－5(osmotin)家族的PR蛋白在离体条件下显示抗微生物活性。在众多的PR蛋白中，研究得最广泛的是PR－3(几丁质酶)和PR－2(β－1，3－葡聚糖酶)。这两种酶是水解酶，水解酶在植物抗病过程中起双重功效，一是直接杀灭侵入的病原菌;二是可能在植物被病原菌侵染后，与过敏性坏死反应的诱发物结合来加速和扩大抗病过程。

(六)防御酶系

寄主防御酶系是指寄主受到病原菌侵染或被诱导处理后产生的一些诱导型抗病因素或直接作用于病原物的酶，主要包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)等。

超氧化物歧化酶(SOD)作为植物细胞防御酶系统中的重要成员之一，主要的功能便是歧化·O2－，产生H2O2和O2，减少活性氧对植物体细胞的伤害。过氧化物酶(POD)，作为 SOD酶的补救系统，常常和过氧化氢酶(CAT)一道，在SOD将活性氧歧化为仍然具有伤害性的H2O2后，进一步将其转化为无伤害的H2O，从而保护植物细胞。多酚氧化酶(PPO)与植物抗病密切相关，它主要参与酚类氧化为醌和木质素前体的聚合作用，其催化形成的醌类物质可以在一定程度上限制毒素的扩散。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物苯丙烷类次生代谢途径中的第一步关键酶和限速酶，它催化苯丙氨酸脱氨基后产生肉桂酸并最终转化为木质素，是与细胞内木质素生成和沉积有关的防御酶［27］。

二、介导植物系统获得抗性的物质

(一)小分子物质

1.内源信号类物质

1)水杨酸

水杨酸(SA)是邻羟基苯甲酸。SA可与过氧化氢酶结合，提供一个电子，SA变为SA自由基(SA·)，抑制过氧化氢酶活性，从而提高了H2O2含量，H2O2或活性氧的衍生物激活抗病途径中抗病相关基因的表达，并且，SA·能够启动脂质过氧化反应，产生许多小分子脂质物如花生四烯酸、茉莉酸、肌醇－1，4，5－三磷酸和双酰甘油等，并且能修饰其他大分子。SA及大量的抗病性诱导化合物都直接或间接地通过一定方式调节过氧化氢酶的作用，如磷酸化和去磷酸化的发生及膜的过氧化，并涉及离子流和活性氧的产生，诱导植物的抗病防卫反应。

外源SA可诱导植物产生系统获得抗病性(SAR)已被许多研究所证实。这种诱导抗性往往具有广谱抗病性的特点，通过人工施用外源SA的方法可以诱导植物产生系统抗性，引起植物体内一系列防御酶活性的提高。刘太国等［28］研究发现外源水杨酸能引起抗病烟草PAL活性升高，进而对TMV产生抗性，但对感病品种没有影响。董霞等［29］利用northern杂交技术对水杨酸诱导不同时间不同烟草GRPs基因的表达模式进行研究，结果表明:水杨酸能诱导烟草GRPs基因上调表达，3h达到最高，然后开始下降，但3个TMV抗性不同的供试烟草增加幅度不同，基因表达幅度与抗性有一定关系。Fodor等［30］发现，抗病信号物质SA处理植株时诱导SOD活性升高，他们认为SOD与抗TMV有关。Alex和John［31］采用绿色荧光蛋白标记的烟草花叶病毒研究了水杨酸对烟草细胞中TMV的抑制作用，发现经水杨酸处理的烟草表皮细胞中TMV的复制不受明显影响，但其移动明显受阻，而叶肉细胞中的TMV复制却明显被抑制，说明水杨酸对相同病原在不同类型细胞中的作用明显不同。

上述研究表明外源水杨酸能诱导烟草相关防御酶活性的增强，进而对TMV产生抗性，但受到烟草品种抗性的影响，以及在烟草不同类型细胞中的作用不同。

2)水杨酸类似物

研究表明，一些水杨酸衍生物也可诱导烟草对TMV产生抗性，如阿司匹林(乙酰水杨酸)，烟草叶片喷施0.05%的阿司匹林溶液可保护叶片免遭TMV的侵染，通过茎部反复注射阿司匹林溶液可诱导烟草产生系统抗性，保护整株不受TMV的侵染，而其诱导的系统抗性与PR蛋白无关［32］。

3)茉莉酸甲酯(MJ)

何红卫等［33］以茉莉酸甲酯(MJ)处理或接种烟草花叶病毒的GH55和K326烟草幼苗为材料，测定一些抗病毒相关酶活性，发现MJ处理提高GH55幼苗的几丁内切酶、几丁外切酶、SOD和脂氧酶活性，降低β－1，3－葡聚糖苷酶活性;MJ处理后接种烟草花叶病毒，K326幼苗的β－1，3－葡聚糖苷酶和SOD活性都降低，显示MJ诱导烟草幼苗抗花叶病毒与几丁酶的关系较为密切，而与SOD的活性关系可能不密切，进一步证实了SA与MJ在植物体内信号转导途径的不同。

2.激素类

杜春梅等［34］将新型病毒剂菌克毒克(宁南霉素)注射于珊西烟下部叶片，上部叶片接种TMV，结果菌克毒克诱导上部未注射叶片对TMV侵染的抗性对侵染的抑制率为65.5% ～82.6%，对菌克毒克处理叶片及上部叶未处理叶片细胞间液中的病程相关蛋白进行电泳分析，结果表明，菌克毒克可系统地诱导珊西烟产生7种健康植株所没有的PR蛋白。伍小良等［35］研究了芸苔素内酯对烟草TMV枯斑抑制作用。

Herms等［36］研究了唑菌胺酯(pyraclostrobin)对烟草抗TMV侵染能力的增强作用，用0.25 μmol/L的唑菌胺酯处理烟草24 h后接种病毒，可使处理烟草上枯斑的平均面积比对照减少50.0%，采用转基因烟草进一步研究其作用机制，结果表明，唑菌胺酯诱导烟草抗TMV作用是通过水杨酸信号途径以外的其他途径。

Yamakawa等［37］的研究表明，精氨酸这种碱性的生物小分子不仅可诱导PR－1基因的表达，而且还可诱导酸性PR－2、PR－3和PR－5基因的表达，烟草接种TMV前用精氨酸处理，可使TMV引起的局部枯斑明显减小。

3.其他小分子物质

一些植物源次生代谢物质也可诱导植物产生抗病毒物质，从而提高植物对病毒的抵抗能力。朱述钧等［38］曾报到了从中草药中提取的多羟基双萘酚(CT)、类槲皮素(EK)和类黄酮(EH)等黄酮类抗病毒物质，均能诱导烟草对TMV的抗性，预防效果最高可达到97.5%。

雷新云等［39，40］从菜籽中提取的一系列脂肪酸，包括亚麻酸、亚油酸、花生酸等，将这些脂肪酸混合施用，也可以起到良好的诱抗作用。车海彦等［41］从锦葵科植物中提取出CT，并由其制成抗病毒剂WCT－Ⅱ，能诱导烟草产生病程相关蛋白(PR)。而张晓燕等［42］对VA的研究表明，VA不仅能提高植株体内与抗病相关的酶活性，还可以诱导增加枯斑三生烟产生的PR蛋白和水杨酸量，并指出其作用机理可能与Ca2+有关。

刘华山等［43］研究了落葵提取液对烟草普通花叶病毒病(TMV)的防效，叶片MDA含量、O2－产生速率及膜透性明显降低，抗氧化物酶SOD、CAT和POD前6d活性增强后下降，Lox和PPO活性始终高于健康或接毒液的烟株;PAL活性是先升高后短时间下降，随后又升高，研究结果暗示，在烟草抗TMV作用中，前期SOD和POD起主要作用，后期PPO和PAL再起作用。

张正坤等［44］研究了臭椿和鸦胆子两种植物提取物抗TMV作用，并且对其中的单体物质鸦胆子素D(BruceineD)的诱抗机理进行了研究，表明BruceineD对POD、PPO同工酶基因的表达可能具有诱导促进作用。而刘国坤等［45］又测试了15种植物提取物中单宁的诱抗效果，选出了三种效果较明显的植物单宁。陈启建等［46，47］从新鲜大蒜中提取的大蒜精油经喷施，可显著提高POD和PPO的活性，降低烟草体内TMV的含量。王海鹏等［48］将来自马齿苋、板蓝根、甘草等3种植物的粗提物混合制成植物源农药VFB，并初步研究了其作用机制及施用方法，证明喷雾加灌根的效果较好。江山等［49］用 NS83、褐藻胶、板蓝根、病毒唑、DHT、DA－DHT等7种抗植物病毒剂，在烟草和甜菜上都可以诱导病程相关蛋白(PR)的产生。

武彦霞等［50］报道了三唑酮对烟草防御酶活性的增强作用，另外，周程爱等［51］报道了β－氨基丁酸(BABA)对TMV的诱抗性，但并未指出其作用机理。值得注意的是，目前在生产上应用的一些病毒抑制剂也具有一定的诱抗作用。

(二)多糖

1.寡聚多糖

寡聚多糖是自然界中一类具有生物调节功能的复杂碳水化合物，一些寡聚糖可以增强植物的抗病性，诱导植物获得系统抗病性。

Rozenn等［52］将β－1，3－葡聚糖通过化学硫酸化后获得β－1，3－葡聚糖硫酸盐，将其处理烟草，表明其可诱导烟草对TMV的免疫，而β－1，3－葡聚糖仅诱导烟草对TMV的微弱抗性，原因是前者引起了烟草体内水杨酸的积累，而后者没有。

Chirkov等［53］研究了来源于甲壳动物的壳聚糖及其降解产物壳寡糖的诱导抗性，推测壳聚糖比壳寡糖的诱抗效果高，但随后商文静等［54－60］通过一系列试验对这一理论进行了反驳，他们认为，这两者在效果上不存在差异，且壳寡糖的水溶性较好，在生产上利用价值较高。他们还指出，经壳寡糖处理的烟草细胞间隙和液泡内出现了大量的电子致密物质，怀疑此类物质可能与烟草的抗病机理有关，另外他们还报道了壳寡糖不仅对TMV有体外钝化作用，并且可以抑制TMV－CP基因的表达，进而影响TMV的长距离运输，对病情发展产生影响，并确定了适宜的施用浓度为50μg·mL－1。随后，刘启顺等［61］报道了壳寡糖的衍生物N－烟酰基壳寡糖的合成及其诱导烟草抗病毒作用，将诱抗结果同商文静的结果进行对比，发现两者的诱抗效果没有显著差异，但这种新合成的衍生物的适宜浓度仅为25μg·mL－1，即壳寡糖用量的一半，具有更高的开发价值。

李红霞等［62］分别采用酶联免疫吸附技术和温室盆栽试验测定了葡聚六糖诱导烟草对TMV的抗性，结果表明:葡聚六糖诱导烟草抗花叶病毒病的最佳有效浓度为10 μg·mL－1，最佳诱导间隔期为 7 d，持效期约为 28 d，且诱导次数对诱导抗性有显著影响。

严凯等［63］研究了 0.5%氨基寡糖素 AS(净土灵)6.25μg·mL－1对烟草花叶病毒(TMV)枯斑寄主心叶烟的枯斑抑制率，以及K326叶片的PAL、POD、SOD活性，同样证实了这类物质具有诱导抗性。

2.S_L 多糖

S_L多糖是由一种田间广泛存在的藜科杂草S_L中筛选提取的抗病诱导剂，它能激活植物的防卫系统。田兆丰等［64］的研究表明，S_L多糖诱导烟草对TMV产生抗性的最佳时间为处理后第5d，S_L多糖能对POD活性产生影响，并且产生更多的可溶性蛋白。

另外，黄金光等［65］从多孔菌MP－01菌株中提取的多糖证实也具有一定的诱抗作用。

3.蛋白类

蛋白诱抗剂是一类能激发植物防御反应基因表达与过敏性反应的特殊信号蛋白，它能通过激发植物自身的抗病功能基因表达，增强植物对病害的免疫能力，并促进植物生长。目前应用于烟草TMV防治的蛋白类物质主要是超敏蛋白。超敏蛋白是由美国康乃尔大学1992年从梨火疫病菌中分离出的一种稳定的多肽类化合物，能够诱导植物过敏反应，激发植物的系统获得抗性［66］。

徐进平等［67］报道了Harpin基因表达产生的蛋白对烟草TMV抗性的诱导。蒋士君等［68］用不同浓度的HarpinEa溶液处理烟草品种，发现30μg·mL－1HarpinEa溶液激发的苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性最高，而处理叶的上一片叶(上位叶)PAL酶活性明显高于对应半片叶和下一片叶(下位叶)的PAL酶活性，但是诱抗效果在不同抗性品种间存在差异。刘勇等［69］以烟苗为材料，研究了3%超敏蛋白微颗粒剂对TMV侵染烟草叶片的保护效果，并指出此浓度可有效促进烟苗生长。闻伟刚等［70］用Harpin蛋白处理烟草，用RT－PCR检测，表明其能与植物互作后通过水杨酸途径激活病程相关蛋白等防卫反应基因转录表达。

另外，吴惠惠等［71］报道了另一种蛋白——细菌蛋白CZ处理NC89再接种TMV，可提高POD和PAL的活性，降低叶片内MDA含量，提高叶绿素含量。

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