树突状细胞与慢性乙型肝炎的关系研究现状

朱其荣综述,秦 波审校

(1.川北医学院附属医院感染科,四川南充 637007;2.重庆医科大学附属第一医院感染科 400016)

树突状细胞与慢性乙型肝炎的关系研究现状

朱其荣1综述,秦 波2△审校

(1.川北医学院附属医院感染科,四川南充 637007;2.重庆医科大学附属第一医院感染科 400016)

树突状细胞;肝炎,乙型,慢性;抗病毒药

1 树突状细胞(dendritic cell,DC)的生物学特征

美国学者Steinman于1973年首次在小鼠脾中发现DC｡DC是目前所知的抗原递呈能力最强的专职抗原递呈细胞(antigen-presenting cell,APC),是自体､异体混合淋巴细胞反应中重要的刺激细胞,作用比其他APC强10～100倍[1]｡未成熟的DC位于抗原入侵部位,具有捕获､处理抗原的能力,但因缺乏T细胞活化所必需的辅助信号分子,如CD40､CD54､CD86､MHC-Ⅰ､MHC-Ⅱ等而不能激活T细胞｡成熟的DC迁移至外周淋巴器官,失去捕获､处理抗原的能力,而获得激活初始型T细胞的能力｡

DC均来源于骨髓多能造血干细胞,分为髓系树突状细胞(DC1)和淋巴系树突状细胞(DC2)｡DC1诱导Th1和CTL反应,DC2诱导Th2反应｡DC2及其前体在外来抗原刺激后分泌大量I型干扰素(α､β),直接通过活化信号的转录子和活化子STAT4促进Th1分化,而Th1和CTL反应对清除病毒感染发挥着至关重要的作用｡

DC表面表达的协同刺激信号包括TNF/TNFR超家族:CD40/CD40L,OX40/OX40L,4-IBB/4-IBBL;RANK/RANKL和免 疫球蛋白超 家 族:CD28/CTLA-4/B7,PD-1/PD-L1/PDL2,ICOS/CL50[2]｡DC表面的一个新型DC特异性的C型凝集素(DC-SIGN)与初始型T细胞表面的ICAM-3高亲和力结合,使DC与初始型T细胞牢固黏附,诱导T细胞活化增殖,在协同刺激信号的参与下,有效的发挥免疫应答作用｡

2 慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)病毒感染与肝脏DC

CHB患者DC功能受损在宿主免疫抑制和病毒持续感染中起着非常重要的作用｡乙型肝炎病毒(hepatitis virus B,HBV)感染者肝脏内DC情况目前知晓甚少,已有研究证实慢性HBV感染者肝小叶内炎症区的HLA-DR+DC位于狄氏间隙,并与淋巴细胞密切接触,而慢性活动性乙型肝炎患者DC位于汇管区周边部[3]｡肝脏DC与骨髓来源的DC的最大区别是Ia抗原的低水平表达,即使提高粒系-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte macrophage colony stimulating factor,GMCSF)的浓度和(或)延长体外培养时间,也不能使肝脏DC的Ia抗原表达增强,说明肝脏DC处于不成熟阶段｡HBV感染人体后定位于肝脏,并在肝脏复制,因此估计机体对病毒的免疫反应起始于肝脏｡持续性HBV感染时,HBV特异性CTL应答减弱或者根本无应答,处于免疫紊乱状态,其产生机制可能与DC有关[4]｡Zhang等[5]研究表明,儿童 HBV感染者肝脏内DC亚型的数量在免疫激活期比免疫耐受期多,并且与血清HBV-DNA载量呈负相关,与血清ALT呈正相关｡HBV感染者肝组织中乙型肝炎病毒表面抗原(HBV surface antigen,HBsAg)阳性DC较多见,肝组织中DC HBsAg阳性率与甘露糖受体(mannose receptor,MR)表达水平呈正相关,HBV感染者MR介导的HBsAg与DC的相互作用及后续的DC的受损主要发生部位在肝脏[6]｡

慢 加 急 性 乙 型 肝 炎 肝 衰 竭 (acute-on-chronic hepatitis B liver failure,ACHBLF)患者肝组织内广泛分布浆细胞样DC(pDCs)､骨髓来源的 DC(mDCs),并且表现型成熟;肝脏内有活性的pDCs能产生IFN-α,体外实验发现IFN-α能诱导浸润肝脏的淋巴细胞产生白细胞介素(IL)-12､IL-10,阻断IFN-α的生成将显著减少IL类细胞因子的产生;同时ACHBLF患者外周血中pDCs的数量显著减少,产生IFN-α的量也显著降低,在那些治疗无效死亡的患者表现尤为明显｡提示ACHBLF患者肝脏内聚集大量有活性的pDCs,并对慢性HBV感染者调节免疫反应[7]｡Tang等[8]研究发现慢性病毒性肝炎(CHB､CHC)患者肝脏淋巴结中pDCs､mDCs的数量与非病毒性肝炎患者､健康志愿者没有差别,而HBV或丙型肝炎病毒(hepatitis virus C,HCV)相关性肝癌患者与单纯性病毒性肝炎患者相比,肝脏淋巴结中成熟的mDCs的数量呈1.5倍降低,pDCs数量呈4倍增加(P0.01),提示病毒性肝炎相关性肝癌患者肝脏淋巴结中DC的组成混乱,这可能是肝癌患者细胞免疫反应不充分的原因之一｡HBV转基因小鼠(HBVTM)肝脏DC在同种异体混合淋巴细胞反应､HBsAg浓缩的T淋巴细胞增殖试验中诱导T细胞增殖的能力显著降低(P0.05),来自 HBV-TM 的肝脏 DC产生IL-12p70､TNF-α､IFN-γ､IL-6的量显著低于来自正常C57BL/6小鼠的肝脏DC,提示HBV-TM的肝脏DC诱导先天免疫和获得性免疫的功能受损,这可能能够解释慢性HBV携带者HBV特异性免疫反应弱或者几乎不可测,从而得到启发,上调原位肝脏DC的功能可能是治疗慢性HBV携带者的方法之一[9]｡

3 慢性HBV感染与外周血DC

HBV感染导致一系列慢性肝脏损伤,HBV逃避免疫监视系统的机制目前仍不清楚｡机体免疫功能降低导致HBVDNA基因组长期存在和HBV感染者疾病进展｡流式细胞仪检测发现慢性HBV感染者外周血中pDC2的数量显著低于健康人(P0.01),ELISA 实验检测发现pDC2产生IFN-α､IL-12的功能也显著减弱,血清中pDC2的数量及CD4+/CD8+的比值在HBV-DNA阳性患者组高于HBV-DNA阴性患者组(P0.01),提示慢性HBV感染者外周血中pDC2数量的降低及pDC2产生IFN-α功能的减弱可能是导致宿主免疫功能降低的原因之一[10]｡有研究显示,DC的功能与HBV基因型有关,HBV B和C基因型感染者外周血pDCs的数量及其产生IFN-α的能力与血清ALT水平呈负相关,在免疫清除阶段未甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)刺激外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)产生IFN-α的量在C基因型低于B基因型患者[11],提示可能与CHB患者抗病毒治疗效果和肝脏炎症进展有关｡

密度梯度离心法从CHB母亲患者全血中分离外周血和胎儿脐带血 PBMC,在含重组人IL-4､TNF-α和 GM-CSF的AIM-V介质培养基中培养,培养的第9天,收集成熟的DC并分析表型,检测DC产生IL-12的量｡CHB母亲的胎儿脐带血的DC表达CD80､CD83水平较正常脐带血､健康成人外周血､CHB成人患者外周血的DC低(P0.05),并且CHB母亲的胎儿脐带血的DC产生IL-12的量也降低(P0.05),提示CHB母亲患者的胎儿脐带血的DC的成熟度和功能都降低[12],这可能与母婴传播HBV容易形成CHB且抗病毒疗效差有关｡在HBV相关性肝硬化和肝癌患者中研究发现肝硬化和肝癌患者PBMC和DC的数量显著降低,DC表达表面分子HLA-DR､CD1α､CD80和CD86降低,混合淋巴细胞反应中DC的刺激能力和上清液中DC分泌的IL-12的水平显著降低;但肿瘤抗原脉冲后DC的水平提高,尤其是肝硬化患者,来自肝硬化和肝癌患者PBMC的DC表型和功能受损可能在HBV感染和肝癌患者的免疫逃逸中起一定的作用[13]｡CHB患者的pDC1表达共刺激分子CD80､CD86减少,自身混合淋巴细胞反应(allostimulatory mixed lymphocyte reaction,AM-LR)受损,DC亚型的前体pDC1数量在肝硬化患者降低,而pDC2在CHB患者和肝硬化患者均降低,CHB患者PBMC分泌IFN-α的量显著降低,提示可能与HBV感染疾病进展有关[14]｡

Li等[15]研究显示慢性乙型重症肝炎(chronic severe hepatitis B,CSHB)患者外周血DC表达toll-like receptors(TLR)1､2､7水平显著增加,TLR-3表达则比CHB患者更低;CSHB死亡病例TLR-3显著减少,TLR-2显著增加;线性回归分析显示,TLR-3水平与疾病严重指标(总胆红素､凝血酶原时间､肌酐､白细胞计数)密切相关,提示 TLR-2､TLR-3可能参与CSHB的发病,TLR-3可能影响CSHB的预后｡脾切除的CHB患者表达CD80､CD1a和 HLA-DR水平显著高于脾肾均切除者,而脾肾均切除的CHB患者IL-10水平高于仅脾切除者,提示CHB患者疾病进展的过程中DC的表型和功能随着TCM(traditional Chinese medicine,TCM)综合征类型的不同而有所差别[16]｡

4 DC的功能状态与血清HBV-DNA载量的关系

RT-PCR和流式细胞仪检测CHB患者DC表达PD-L1､PD-L2水平,并检测血循环中DC产生增殖同源T细胞的潜能,实时PCR检测血清HBV-DNA滴度,同时测定HBV标志物和肝功能,结果显示CHB患者血循环中PD-L1表达呈正调节(P0.01),HBV-DNA 载量大于106copy/mL的 CHB患者其血循环DC表达PD-L1的水平高于HBV-DNA载量小于106copy/mL的CHB患者(P0.05),血循环 DC表达 PD-L1水平与血浆病毒载量呈正相关;CHB患者血循环DC的潜能显著降低,在体外应用抗PD-L1单克隆抗体阻断PD-L1表达能够增加DC产生同源T细胞的能力,提示CHB患者DC产生高水平的PD-L1与T细胞耗竭和高 HBV-DNA载量有关[17]｡分离CHB患者PBMC,在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中加入 GM-CSF､IL-4､TNF的作用下孵育7d,FACS检测DC的数量和表型,发现CHB患者的DC数量､DC表达表面分子CD83､CD86的量显著减少(P0.05),DC指数与血清 HBV-DNA 呈负相关(P0.05)[18]｡Gao等[19]发现HBV-DNA水平小于或等于106copy/mL的CHB患者比HBV-DNA水平大于106copy/mL的CHB患者pDCs的数量增加(P0.05),而mDCs水平与病毒载量无明显相关｡提示CHB患者外周血DC的功能和成熟存在缺陷,DC的功能状态与HBV-DNA载量密切相关,因此寻找恢复或者改善DC功能的方法将可能对治疗CHB带来希望｡

也有学者提出CHB患者的DC的增殖速度显著低于健康人,CHB患者DC表达表面分子低于健康人,尤其是HLADR,CD86,CD80和 CD83分子,但这种差别在 HBV-DNA>105copy/mL的高病毒载量组和 HBV-DNA103copy/mL的低病毒载量组间差异无统计学意义;混合淋巴细胞反应中DC的刺激能力在两组不同病毒载量患者间也无差异[16,20]｡

5 抗病毒治疗对DC的影响

目前已上市用于治疗CHB的抗病毒药包括IFN类(普通IFN､聚乙二醇IFNα-2α)及核苷类似物(拉米夫定､阿德福韦酯､恩替卡韦､替比夫定),其共同点是只能抑制病毒,不能清除病毒,疗效尚不令人满意｡研究已证实DC在HBV感染疾病进展中发挥至关重要的作用,对DC的进一步研究将对CHB的治疗有益｡

5.1 IFN对DC的影响 IFN可调节T细胞及B细胞功能,促进巨噬细胞及NK活性,促进细胞表面组织相容性白细胞抗原的表达,从而起到调控免疫应答的作用｡聚乙二醇IFNα-2α治疗4周时mDCs产生的B7-H1､CD4+T细胞及CD8+T细胞的数量显著增加,4周以后,抗病毒应答者B7-H1的表达持续降低,而无应答者的B7-H1的表达维持在高水平｡在应答者,产生HBV特异性IFN-γ的T细胞数量显著增加,而在无应答者则显著降低｡无论是应答者还是无应答者,阻断B7-H1信号转导通路将增加产生HBV特异性IFN-γ的T细胞的数量[21],说明聚乙二醇IFNα-2α治疗CHB时T细胞和 mDC表达B7-H1的动态变化能够预测抗病毒治疗的效应,抑制B7-H1信号转导通路可能增强抗病毒后的T细胞免疫反应｡

IFN-α治疗CHB患者3个月结束时显示外周血单核细胞的CD1αDC的百分比增加,HBV-DNA转阴的患者CD1αDC的增加更显著,同时CD1αDC表达HLA-DR､CD80和ICAM-1也增加｡提示在体内CD1αDC能够被IFN-α诱导,并且免疫相关分子 HLA-DR､CD80和ICAM-1上调[22],这可能是IFN-α治疗CHB患者的重要的免疫相关机制之一｡

IFN-α治疗CHB儿童患者52周,分别于抗病毒前､抗病毒后2､12､24､36､52周检测 mDCs､pDCs的数量和功能,发现所有患者抗病毒治疗之前pDCs数量明显减少,IFN-α治疗前2周内由CpG诱导的内源性IFN-α的产生量也明显降低,抗病毒治疗应答者在治疗过程中pDCs的数量和功能不断增加,并于12周达到高峰,同时伴随着病毒清除､HBeAg血清学转换､循环中mDCs和Th1细胞增加,而抗病毒治疗无应答者DC亚型无变化,提示pDCs与CHB儿童患者IFN-α治疗清除病毒有关[23],IFN-α治疗CHB患者时血中pDCs数量和功能的恢复可能是抗病毒治疗疗效的良好预测指标｡

5.2 核苷类似物对DC的影响 Zheng等[24]发现拉米夫定在体外作用于从CHB患者分离的DC时,DC表达CD1α､CD83､HLA-DR显著增加,同时DC分泌IL-12的水平也显著升高(P0.05),刺激同种异基因混合白细胞反应的能力也增强,提示从CHB患者来源的DC,其表型分子表达低下和同种混合淋巴细胞反应受损的状况,在体外与拉米夫定共培养时可能得到恢复｡Li等[25]观察拉米夫定治疗CHB患者时循环DC和淋巴细胞亚型的变化,发现持久应答组,DC表达HLA-DR在12周时出现短暂下降,48周时恢复(P0.05);48周时,CD80､CD40和 CD1α较基线水平升高(P0.05),而 YMDD变异组,DC表达的CD83和HLA-DR水平在拉米夫定治疗12周时下降(P0.05),HLA-DR一直较基线水平低(P0.05)｡持久应答组,拉米夫定治疗12周时淋巴细胞亚型没有显著变化,但与基线水平相比,48周时CD4+T细胞升高,NK细胞下降(P0.05),而YMDD变异组,淋巴细胞亚型没有显著变化｡拉米夫定治疗CHB患者1个月后外周血中DC的T细胞增殖能力较治疗前显著增高,治疗后3､12个月与治疗后1个月相比没有显著变化,DC的活性没有进行性增加[26]｡

阿德福韦酯治疗CHB患者6个月,治疗结束时mDCs的数量､协同刺激作用､成熟度均显著增加,并且mDCs产生TNF-α､IL-12的能力增强,而pDCs的数量和功能在治疗前后没有明显变化[27],这可能是抗病毒治疗疗效不持久的原因之一｡Lu等[28]调查了恩替卡韦对CHB患者DC的影响,发现恩替卡韦组DC表达CD1α､CD83､CD80､HLA-DR水平显著高于对照组(P0.05),恩替卡韦组DC分泌IL-12水平显著高于对照组,IL-6水平低于对照组,而且恩替卡韦组DC刺激淋巴细胞增殖的能力也显著高于对照组,表明恩替卡韦治疗CHB能增强DC的生物学活性｡以上可看出核苷类似物治疗CHB患者可能会增加DC数量和改善DC的生物学特性从而提高机体免疫,但由于目前这方面研究尚少,需更多的循证医学证据支持｡

总之,现有研究表明CHB患者DC的数量和功能降低,对DC的进一步研究将对CHB的治疗开辟广阔的前景,特别是对免疫耐受期的患者,打破机体免疫耐受状态,提高机体免疫应答机制,可有效提高临床治疗效果｡

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10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.036

A

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△通讯作者,Tel:15923261188;E-mail:cqqinbo@126.com｡

2011-10-09

2012-01-09)

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