骨性关节炎软骨细胞凋亡的研究

马 钢 任明姬

（内蒙古医学院第二附属医院； 1内蒙古医学院组织胚胎学教研室，呼和浩特010059）

骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种主要累及负重关节（如膝、髋关节）的慢性、退行性疾病，以软骨丢失、软骨下骨改变、滑膜炎和其他的关节组织改变为特征，临床上以关节疼痛、肿胀、活动受限、关节畸形等为主要表现［1－3］。众所周知，OA是老年人群致残性的疾病，在我国患病率高达9.56%，随年龄增长，38-60岁者可达78.5%。研究发现，导致OA发病的危险因素包括年龄、遗传、体质、肥胖、解剖结构异常、过度负重及关节损伤等，晚期的治疗仍以关节置换为主，但是目前尚无有效的防治措施。以往研究大多侧重于软骨基质降解和合成平衡的失衡，很少注重软骨细胞生存或死亡在OA关节软骨降解过程中所起的作用。近期国内外的研究发现，骨性关节炎与软骨细胞凋亡密切相关［4］。本文就目前国内外对软骨细胞凋亡与OA关系的研究进展进行综述。

1.软骨细胞凋亡和OA

凋亡（apoptosis），又称细胞的程序性死亡，是一种由基因控制的、主动地去除非需要或损伤细胞的程序性死亡过程，与生长、发育以及内环境稳定密切相关。

软骨细胞是成熟软骨组织内唯一的细胞类型，它在软骨损伤以及重塑过程中起到维持内环境平衡的作用。与一般细胞凋亡相比，OA软骨细胞凋亡有其独特性：①软骨基质小泡与凋亡小体同样具有碱性磷酸酶和三磷酸核苷酸磷酸脱氢酶（NTPPH）活性，并能使钙沉积；②软骨细胞发生凋亡时，凋亡小体无法被巨噬细胞带走而滞留在关节软骨内，影响关节软骨正常生理功能，只有当软骨基质发生降解，凋亡小体才有可能被释放到关节间隙中而被清除；③软骨细胞凋亡与基质降解密切相关［4，5］，当关节软骨细胞过度凋亡时，基质合成减少，并逐渐形成恶性循环。越来越多的证据表明，软骨细胞凋亡与OA 发生发展密切相关［4，6，7］。软骨表面及软骨中有许多类似溶酶体和基质小泡样空的腔隙，是软骨细胞凋亡所致，机械损伤、活性氧（ROS）增加、细胞外基质完整性破坏、细胞分泌生长因子丢失等诸多因素都与之有关［8］。软骨中软骨细胞凋亡并非同时发生，这和OA软骨退化是一个缓慢的过程相符合。有研究发现OA关节软骨细胞凋亡主要位于软骨表层和中层，而正常关节软骨细胞也可出现凋亡，但检出率低，且主要位于表层。也有研究发现，OA中软骨深层可能也有凋亡产生，这是由于OA软骨浅层纤维化，所以Fas在软骨较深层表达的缘故。

近年来学者们研究证实OA严重程度和软骨细胞凋亡数量之间存在着重要的相关性。对动物［4，9，10］或人［4，11］进行体外及活体 研究显 示：在 OA中凋亡软骨细胞的比例增高，说明在OA中细胞凋亡的确在发挥作用。对于鉴定软骨细胞凋亡引起的细胞超微结构的改变，电镜是目前唯一的“金标准”。

最新的一项研究发现［12］，在OA不同发病阶段和不同软骨退化区域，软骨细胞死亡可能同时包含了细胞凋亡和自噬的破坏机制，自噬不同于凋亡和坏死，自噬早期，软骨细胞中可见染色质杂乱无序地凝结，细胞质中高尔基体和内质网增多，晚期可见自体吞噬泡，细胞外基质囊泡集聚。在人OA TUNEL染色阳性的软骨细胞中，高尔基体58K蛋白与 Caspase-2L 重叠证实了这种观点［13］。至于chondroptosis具体机制，目前尚不清楚，还有待于进一步研究。

2.软骨细胞凋亡信号传导的上游通路

软骨细胞凋亡的信号转导通路十分复杂，是目前国内外研究的热点问题，上游主要涉及MAPKs信号转导通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-Akt通路、JAKs／STATl信号转导通路、Wnt／β-catenin信号通路及核因子κB通路。

2.1 MAPKs信号转导通路

MAPKs通路是细胞外信号由细胞膜传至细胞核的一条信息大道。目前，在哺乳动物细胞中已确定有3条MAPKs信号通路：胞外信号调节蛋白激酶（ERK）通路、c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路和p38蛋白激酶通路。一般认为，JNK和p38主要抑制细胞的生长，促进细胞凋亡，而ERK则刺激细胞生长所需的生长因子和激素的激活，参与调节细胞的增殖。

JNK信号通路在细胞的存活与凋亡中起着非常重要的作用。JNK短暂的激活可使细胞增殖，而持久的激活则引起细胞凋亡［14］。JNK的靶标包括AP1相关的转录因子（如c-Jun）、TNF-α和IL-1等细胞因子，可以诱导短暂的MAPK激活，参与基因表达、细胞增殖和分化。JNK信号转导通路的大致模式可归纳为：应激反应等→生发中心激酶（GCK）→MEKK→SEK1→JNK→生长阻滞、凋亡。

p38信号通路是关节软骨细胞凋亡的上游信号通路之一，与软骨细胞表型的维持和分化、软骨细胞的肥大和钙化、软骨细胞的凋亡、软骨基质金属蛋白酶的合成、炎性细胞因子的产生等密切相关，在OA的发生发展中起重要作用［15］。在NO诱导的软骨细胞凋亡过程中，p38通过使p53蛋白表达增加而引起软骨细胞凋亡。在CD95介导的OA软骨细胞凋亡和坏死中，p38通过激活ATF-2和Caspase-3，介导软骨细胞凋亡信号的转导［16］。

2.2 磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）／Akt通路

PI3K／Akt对多种不同细胞的生存有重要作用。近期研究表明［17］，PI3K／Akt途径变化与 OA软骨细胞凋亡的发生发展密切相关。在正常关节软骨细胞内，PI3K／Akt途径具有促进软骨细胞增殖和抗凋亡的作用。激活后的Akt主要通过对含有丝氨酸残基或苏氨酸残基的底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应，包括抗凋亡、促细胞增殖功能。目前已发现多个 Akt底物，如 Bad、NF-κB及caspase－9等。当NO作用于软骨细胞时，使PI3K和Akt活性下降，抑制PKCα和PKCζ，进而使软骨细胞去分化，细胞凋亡，而这种作用能被IGF-l阻断。骨形成蛋白-2（BMP-2）通过抑制caspase-3和caspase-9、增加Bcl-xL的表达而阻止软骨细胞凋亡，其信号转导是通过PI3K／Akt途径。

2.3 JAKs／STAT1信号传导通路

JAKs／STAT1信号途径从分子水平调节细胞的增殖、分化以及凋亡。STAT1是STAT家族发现的第一个成员，介导细胞凋亡过程的信号转导，它使细胞生长抑制，负性调节c-myc启动子表达。JAKs／STAT1信号途径被激活后，STAT1能增加凋亡信号通路下游的Caspase表达，Bcl-2／Bax比例下降，并伴有凋亡软骨细胞出现［18］。在对STAT1基因剔除小鼠的研究中发现，STAT1基因剔除小鼠在整个生长期的凋亡水平比一般小鼠低，在转染FGF基因的原代培养软骨细胞中，FGF诱导的软骨细胞凋亡可因STAT1基因剔除而减少［19］。

2.4 Wnt／β-catenin信号通路

Wnt／β-catenin信号通路主要包括：细胞外因子（wnts），跨膜受体（frizzled）、连环素蛋白（β-catenin）及 T 细 胞 因 子／淋 巴 增 强 因 子 （T cell factor／Lymphoid enhancer factor，Tcf／Lef）等 一 系 列 蛋白。当wnts与膜受体frizzled结合后，信号转导入胞内，引起一系列胞质蛋白的相互作用进而使βcatenin蛋白在胞质内累积，β-catenin累积到一定量即进入核与转录因子Tcf／Lef共同作用激活靶基因的转录。Wnt／β-catenin信号通路的下游靶基因多数是参与细胞增生与凋亡的基因，如cylinD1、MYC等。Frzb蛋白能在细胞外与Frizzled竞争结合Wnt，抑制Wnt信号向细胞内传导，它还可以抑制MMP-2的表达活性［20］。DKK-1（Dickkopf-1）可通过与Lrp5／6相结合在 Wnt／β-catenin信号通路中起对抗作用。有研究发现，炎症可抑制DDK-1的表达，激活 Wnt／β-catenin信号通路［21］。Smurf2可经过一系列作用，导致β-catenin蛋白在细胞中积累，在Col2a1-Smurf2转基因关节软骨的研究中，已证实了两者之间的相关性［22］。

2.5 核因子κB通路

核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）通路是细胞在各种细胞因子作用后广泛被激活的信号转导通路，具有促细胞存活和凋亡的双向作用。在静息状态时，NF-κB二聚体通常与其抑制性κB蛋白（inhititorκB，IκB）非共价结合以无活性的三聚体形式存在于细胞浆中，当细胞受到胞外信号刺激时（TNF、IL-1等），与膜受体特异结合并改变受体空间构象，从而激活NIK，NIK进一步激活IKKs，使IκB构象改变，NF-κB随即释放，以有活性的二聚体形式转位到胞核，结合到启动子／增强子区域，激活靶基因，发挥抗凋亡或促凋亡作用，这与细胞的种类和细胞外的刺激有关。在原代的软骨细胞中，NF-κB通过增加凋亡蛋白抑制物（IAP）与Bcl-2表达水平而抑制软骨细胞的凋亡。

3.软骨细胞凋亡的下游途径

软骨细胞凋亡的下游途径主要包括：线粒体途径、死亡受体途径和内质网应激反应性凋亡途径。

3.1 线粒体途径

线粒体不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡的调控中心。在线粒体途径中，线粒体通透性改变是凋亡的关键步骤。OA软骨细胞线粒体跨膜电位下降，通透性转变孔道（PTP）开放，外膜通透性增高，位于膜间隙的可溶性蛋白，包括细胞色素C（cytochrome C）、线粒体促凋亡蛋白Smac／Diable、天门冬氨酸半胱氨酸蛋白酶（Caspase）前体、凋亡诱导因子（AIF）以及内切核酸酶G（endonuelease G，endo G）等被释放到细胞质中，这些蛋白或激活Caspase途径，或独立的与细胞核内染色体作用，引起细胞凋亡。大多数研究认为，AIF和endo G依赖的细胞凋亡是非Caspase依赖性的，且不受Bcl-2过表达的影响。

3.2 死亡受体途径

已知 的 死 亡 受 体 包 括 Fas、TNFR-1、DR3、D114、DR5等，其中研究最透彻的是Fas／FasL系统。OA软骨细胞3个Fas受体与1个FasL结合后，通过胞内死亡结构域（death domain，DD）与其适配子FADD羧基端的DD相互作用，使FADD相互聚集，同时，FADD的死亡效应域（death effeetor domain，DED）与 Caspase-8原域中的 DED 相互作用，结合形成大分子复合物凋亡酶体（apoptosome）。Fas、FADD 与 Caspase-8构成死亡诱导信号复合体（DISC）。在DISC中，Caspase-8自活化，启动级联反应，激活下游的效应Caspase，如Caspase-6，Caspase-7和 Caspase-3，而 Caspase-3可以激活DNA降解酶，降解DNA成为特异性片断，导致细胞凋亡的发生。

3.3 内质网应激反应性凋亡途径

内质网在维持细胞内钙离子内环境稳定以及膜蛋白的合成、修饰和折叠等方面发挥关键性作用。当某些刺激造成未折叠或折叠异常蛋白质在内质网内大量堆积时，均会导致内质网应激反应（endoplasmic reticulum stress，ERS）。PERK、ATF6和IRE-1介导的信号转导不仅是纠正内质网功能紊乱的重要机制，在持久、强烈应激刺激条件下，内环境紊乱无法纠正，PERK、ATF6和IRE-1同样会启动凋亡机制，诱导细胞凋亡［23］。在已知的14种caspase中，caspase-12与ERS性凋亡途径密切相关，caspase-12对非内质网凋亡刺激无反应，仅在ERS刺激下，由ER膜移位到胞质后序贯激活caspase-9 和 caspase-3，引 起 细 胞 凋 亡。 并 且caspase-9的激活不需要线粒体和Apaf的参与［24］。大量研究表明，内质网在软骨细胞凋亡信号处理过程中发挥重要作用，导致下游Caspases和其他蛋白酶的激活，但机理还不明确［25］。

4.关节软骨细胞凋亡相关癌基因表达

软骨细胞的存活依赖于癌基因之间的平衡，p53基因、Bcl-2基因家族、c-myc基因、ICE 基因家族等均可调控软骨细胞凋亡途径。

4.1 p53基因

p53基因位于17号染色体，在正常的关节软骨细胞中无表达，在退变的关节软骨细胞中可见阳性表达，是DNA修复和细胞周期中十分重要的调节因子，也是限制细胞生长和导致细胞凋亡的关键信号。在有关兔的膝OA研究中发现，p53mRNA水平、凋亡细胞数量均明显升高，从而提示p53在关节软骨细胞凋亡中发挥了重要作用。野生型p53基因可促进NO诱导的软骨细胞的凋亡，其机制可能是p53基因表达产物的聚集使Bax的表达增加，进而释放细胞色素C并激活Caspase，导致细胞发生凋亡。

4.2 Bcl-2基因家族

Bcl-2家族通过蛋白与蛋白间相互作用调节着细胞的存活与凋亡。其中，抑制细胞凋亡的Bcl－2与促进细胞凋亡的Bax相互作用是调节中心。该基因家族通过以下途径来调控细胞凋亡［26］：①Bax促进线粒体通透性转换孔（PTP）开放，线粒体的内、外膜依次裂解，释放出Caspase，激活蛋白，诱导细胞凋亡，而Bcl-2、Bcl-X1抑制PTP开放，阻止细胞凋亡；②Bcl-2直接或间接阻止细胞色素C（CytC）从线粒体释放，抑制细胞凋亡；③Bcl-2蛋白表达量上升，形成了比Bax-Bax更稳定的Bax-Bcl-2异源二聚体，从而“中和”了Bax-Bax诱导细胞凋亡的作用；④定位于内质网膜上的Bcl-2可能通过阻断Ca2＋从内质网向胞质中的流动，使依赖Ca2＋的核酸内切酶活性降低，从而阻断细胞凋亡；⑤Bcl-2通过抗氧化剂或抑制氧自由基的产生而发挥其抑制细胞凋亡的功能。马春辉［27］对原发性OA、继发性OA和正常关节软骨通过逆转录／聚合酶链反应（RT-PCR）检测Bax／Bel-2mRNA，发现原发性OA中BaxmRNA和Bcl-2mRNA均升高，而继发性OA中只有Bcl-2mRNA升高。

4.3 c-myc基因

人类c-myc基因定位于第8对染色体上，由3个外显子构成，其表达产物是含有439个氨基酸的蛋白质，存在于细胞核内。c-myc在正常软骨细胞核中无表达，但在凋亡的软骨细胞核中呈散在表达。在对比正常人关节软骨细胞与OA关节软骨细胞的研究中，发现OA关节软骨细胞凋亡的程度与软骨退变的程度呈正相关，且c-myc参与了软骨细胞凋亡的全过程。c-myc引起细胞凋亡的机制可能是由于正常细胞周期不平衡，细胞生长受到抑制，c-myc不成比例表达，导致细胞凋亡。

4.4 ICE基因家族

ICE基因家族白介素-1β转化酶（Interleukin－1βConverting Enzyme，ICE）是一种半胱氨酸转化酶，人类细胞中与ced-3同源的分子被统一命名为半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase），Caspase以发现先后顺序命名，ICE被称为Caspase-l，有人将Caspase称为ICE家族，Caspase家族成员是细胞凋亡信号传导过程中的一类重要蛋白酶，其活化可激活DNA内切酶，最终导致DNA片段化和凋亡发生。

5.软骨细胞凋亡与基质崩解

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）各成分平衡是维持各层软骨细胞活性的重要条件，软骨细胞凋亡与软骨基质崩解密切相关。连续切片显示，OA患者关节软骨富含凋亡细胞的区域伴有大量蛋白多糖降解，表层软骨细胞凋亡最多，且基质降解最严重。对于软骨细胞凋亡与ECM的关系，目前研究推测：①Ⅱ型胶原缺乏的软骨细胞间基质不能供养软骨细胞，进一步促进细胞凋亡。②肥大细胞表型X型胶原的表达，引起软骨细胞凋亡。

在骨性关节炎中，软骨细胞外基质的降解，可使细胞生存环境及生存信号丧失而导致软骨细胞凋亡，而细胞结构的破坏可使基质合成减少，增殖细胞随之发生的凋亡，也限制了基质的修复。ECM的降解产物亦可影响凋亡，蛋白多糖聚合物的降解产物之一G1结构域由于与透明质酸的结合不易进入循环系统，易在滑液中及软骨中积累，通过降低细胞间粘附诱导软骨细胞凋产。另外，一些物质具有诱发凋亡和激活基质降解的双重作用，如IL-1既可诱导前列腺素、NO的合成，又可抑制X胶原、蛋白多糖的合成。

6.抑制细胞凋亡为基础的骨关节炎治疗的研究思路

通过对骨关节炎中软骨细胞凋亡机制的研究，将凋亡调控在正常范围内，这将为骨关节炎的治疗开辟新思路。到目前为止，还没有关于人类的临床实验证实把抑制细胞凋亡作为骨关节炎治疗的手段。但是，已有动物实验证明通过抑制软骨细胞凋亡来控制骨关节炎的发展。例如：在软骨凋亡严重的部位使用Bcl-2基因，抑制引发骨关节炎的凋亡；再如：使用小分子药品调控细胞凋亡表达的相关基因或影响其信号传递，从而抑制OA发展过程。D'Lima等［28］向兔骨关节炎模型的关节内注射Caspase抑制剂，与关节内注射生理盐水的模型组作为对照，结果证实Caspase抑制剂在减少软骨细胞死亡和保护关节软骨方面优于对照组。

中医学对骨性关节炎的认识历史悠久，认为其与筋骨失养，气血亏虚，痰瘀凝滞，劳损及外伤致病等因素相关，本病本虚标实，属“骨痹”范畴，已有长期的临床用药实践，疗效肯定。目前许多学者正通过现代分子生物学技术的应用，进一步研究其有效机制和作用靶点。已有研究证实，中药可调节关节软骨细胞的凋亡率［29］。

蒙医是蒙古族在长期的医疗实践中逐渐形成与发展起来的传统医学，是一门具有鲜明民族特色和地域特点的医学科学，在我国民族药中占有重要地位。蒙医学认为骨性关节炎亦属中医“痹病”范畴，蒙医结合中医及西医，运用其独特的蒙药和疗法，在治疗骨性关节炎方面取得了较显著的疗效。蒙药是否影响骨性关节炎软骨细胞的凋亡，结论尚不确定，具有较广阔的研究前景。可能成为防治骨性关节炎的一个新方法。

近年来研究显示，骨关节炎关节软骨降解的发生除因软骨基质降解和（或）基质合成受到抑制外，软骨细胞凋亡异常也是一个重要原因。随着对软骨细胞凋亡研究的深入，发现软骨细胞凋亡和骨关节炎的发生发展十分密切。目前对其发生机制以及各种因素之间相互作用的关系尚不清楚，有待进一步深入研究，为OA的防治提供新的理论依据和新思路。

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