TRAIL联合顺铂对小鼠移植型肝癌抑制作用及机制研究

李京敏 宁巍巍 刘同慎 王 东 白咸勇

TRAIL联合顺铂对小鼠移植型肝癌抑制作用及机制研究

李京敏 宁巍巍 刘同慎 王 东 白咸勇＊

（滨州医学院组织学与胚胎学教研室 山东烟台264003）

目的 探讨肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）联合顺铂（cisplatin，DDP）对小鼠移植型肝癌的抑制作用及机制。方法 将H22小鼠移植型肝癌模型随机分为生理盐水组、TRAIL组、TRAIL＋DDP组和DDP组，称取瘤重并分析抑瘤率，Hoechst 33342荧光染色法检测细胞凋亡，免疫组织化学染色检测Caspase-3表达。结果 与生理盐水组比较，TRAIL、DDP对小鼠移植型肝癌生长具有明显的抑制作用（P＜0.05）；TRAIL与DDP联合用药具有增效作用（P＜0.05），可明显提高肝癌细胞的凋亡率（P＜0.05）、上调Caspase-3表达（P＜0.01）。结论TRAIL与DDP联合用药对小鼠移植型肝癌生长具有协同抑制作用，其机制可能与其协同促进Caspase-3的表达有关。

肝癌；肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体；顺铂；Caspase-3

TRAIL是近年来发现的肿瘤坏死因子家族的新成员，可选择性诱导转化细胞、肿瘤细胞和病毒感染细胞发生凋亡，而对正常组织及细胞无明显毒副作用［1，2］。TRAIL的这种特殊生物学效应，对于临床抗肿瘤治疗具有重要意义。研究报道，TRAIL可诱导多种肿瘤细胞凋亡。一些肿瘤细胞对TRAIL耐药，但通过与化疗药物联用可增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性［3-6］。鉴于体内肿瘤微环境与体外肿瘤细胞培养环境的差异，本实验通过建立小鼠原位移植型肝癌模型，采用TRAIL与DDP联合用药对肝癌的生物学效应及作用机制进行了研究，以期为肝癌的临床治疗提供新的途径。

1.材料

昆明小鼠购自烟台绿叶制药有限公司，小鼠H22肝癌细胞株购自山东大学医学院免疫学实验室，人重组可溶性TRAIL由成都地奥制药集团有限公司惠赠，注射用顺铂冻干型购自齐鲁制药有限公司，Hochest33342购自美国Sigma公司，兔抗Caspase-3多克隆抗体，购自北京博奥森生物工程有限公司。

2.动物分组和模型制作

选取体重25g左右昆明小鼠40只，随机分为4组：NS组、TRAIL组、TRAIL＋ DDP组、DDP组。将H22荷腹水瘤小鼠的腹水在小鼠腹腔内连续传代3次后，取腹水稀释至细胞浓度2.5×107个／ml，用1 ml注射器注入模型小鼠肝左叶内（体积最大），每只0.03 ml。手术后第6d开始给药，采用腹腔注射0.01 ml／g动物体重，分别给予 NS、80μg TRAIL／kg、3 mg DDP／kg、80μg TRAIL／kg ＋3 mg DDP／kg。每3d给药1次，共6次。

3.标本采集

最后一次给药3d后脱颈处死小鼠，大体观察肝脏，切取瘤块，称瘤重。4%多聚甲醛固定肿瘤组织，常规石蜡包埋。进行4μm连续切片，HE染色，光学显微镜下观察肝组织病理学变化。

4.Hoechst33342荧光染色法检测细胞凋亡

将4μm组织切片常规脱蜡至水，用PBS洗5 min，滴加Hoechst33342染液，避光作用10 min，甘油封片，使用共聚焦激光扫描显微镜紫外光（360nm）激发，显示为明亮的蓝色荧光。凋亡细胞的判断标准：胞核中染色质出现浓缩、荧光增强，细胞核裂解为碎片或者出现3个或3个以上的荧光碎片判为凋亡细胞。每张切片观察100个细胞，计数凋亡细胞数。

5.Caspase-3免疫组织化学染色（SP法）

将4μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢甲醇处理30 min，柠檬酸缓冲液微波修复10 min，正常羊血清封闭30 min，滴加兔抗Caspase-3多克隆抗体（1：200）4℃过夜，滴加生物素标记羊抗兔Ig G 37℃孵育30 min，DAB显色。阳性结果判断标准：光镜下观察，细胞质或胞核内有弥漫分布的棕黄色颗粒沉积。图片采用I MAGE-PROPLUS图像分析系统进行分析，结果以平均光密度值表示。

6.统计学处理

所有实验数据以（¯x±s）表示，采用SPSS 13.0软件包进行析因设计方差分析和Bonf err oni法两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.肝脏病理学变化

肉眼观，可见模型小鼠肝左叶有类圆形白色结节形成，呈膨胀性-浸润性生长，与周围组织边界清楚。光学显微镜下观察，可见肿瘤组织呈团块状生长，周围有大量炎性细胞浸润；在高倍镜下观察，肿瘤细胞异型性明显，核大，有多个核仁，可见瘤巨细胞和核分裂相，肿瘤中心可见大片坏死。（图1）。

2.瘤重及抑瘤率分析

实验结果显示：TRAIL与DDP单独用药组的瘤重均低于NS组瘤重，差异有统计学意义（P＜0.05）；TRAIL与DDP联合用药对肝癌生长抑制具有交互作用，与TRAIL组、DDP组瘤重比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明两者联用能够协同抑制小鼠移植型肝癌生长。

表1 各组瘤重及抑瘤率比较（n＝5，¯x±s）Table 1 Comparison of tu mor weight and inhibitor y rate in different gr oups（n＝5，¯x±s）

3.Hoechst 33342染色

实验结果显示，TRAIL组、DDP组凋亡细胞数均高于NS组，差异有统计学意义（P＜0.05）。TRAIL和DDP联合用药具有交互作用，能够促进肝癌细胞凋亡，差异有统计学意义（P＜0.05）。（图2）

4.Caspase-3的表达

光学显微镜下观察：各用药组癌组织中均可见大量Caspase-3阳性表达癌细胞，这些癌细胞体积较大，核大，胞质少。（图3）TRAIL与DDP单独用药组癌组织内Caspase-3的表达均高于NS组，差异有统计学意义（P＜0.01）；TRAIL和DDP联合用药对Caspase-3在癌组织的表达有交互作用（P＜0.01），两种药物联用对Caspase-3的表达增高有协同作用（P＜0.01）。

表2 各组细胞凋亡数比较（n＝5，¯x±s）Table 2 Co mparison of apoptotic cells in different groups（n＝5，¯x±s）

表3 Caspase-3在各组癌组织中的表达（¯x±s）Table 3 Expression of Caspase-3 in cancer tissues in different groups（¯x±s）

图1 小鼠肝脏病理学变化（HE染色）图2 Hoechst 33342染色结果。×1000图3 Caspase-3在癌组织中的表达。（SP法 ×400）Fig.1 The pathological changes of liver tissues in mice（HE stainning）；1 A：Nor mal liver tissues（HE stainning ×100）；1B：Nor mal liver tissues（HE stainning ×400）；1C：Liver cancer tissues（HE stainning ×100）；1D：Liver cancer tissues（HE stainning×400）Fig.2 Result of Hoechst 33342 staining.×1000；2A：NS group；2B：TRAIL group；2C：DDP group；2D：TRAIL＋DDP groupFig.3 Expression of caspase-3 in cancer tissues.（SP method×400）；3A：NS group；3B：TRAIL group；3C：DDP group；3D：TRAIL＋DDP group

讨 论

研究表明，TRAIL对大部分肿瘤细胞有明显的凋亡诱导作用，但大多数肝癌细胞系对TRAIL具有耐药性。Shin［7］等单独用TRAIL处理肝细胞肝癌（HCC）细胞系，结果发现几乎所有的细胞系均对TRAIL表现耐药，但TRAIL与DDP联合用药，可增加HCC对TRAIL的敏感性；TRAIL与化疗药物联用对肝癌细胞具有更显著的增殖抑制和凋亡诱导作用［8，9］。在体内，肿瘤细胞增殖与宿主代谢以及体内药物的相互作用相当复杂，并受多种因素调控，而且肝内的免疫环境非常复杂。鉴于此，我们设计了本实验。实验结果表明，TRAIL组的瘤重及抑瘤率与NS对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），说明TRAIL对肝癌生长有一定的抑制作用，但与传统化疗药物DDP相比，其单一用药治疗效果不理想。这可能与体内肿瘤微环境较为复杂有关，其机制有待进一步研究。同时，实验结果显示：TRAIL与DDP联用组与其他三组比较，对小鼠移植型肝癌生长具有更明显抑制作用，TRAIL与DDP配伍有增效作用，可明显提高肝癌细胞的凋亡率、上调肝癌细胞 Caspase-3的表达。Siervo［10］等研究发现，TRAIL和顺铂联合用药能够协同上调卵巢癌细胞TRAIL受体DR4、DR5的表达、下调Dc R1的表达、协同下调抗细胞凋亡基因Bcl-2和Bcl-x L 的 表 达、促 进 Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-10活化，从而增加了卵巢癌细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感性。TRAIL主要是通过与细胞膜上的相应受体结合而发挥生物学效应。TRAIL与死亡受体DR4、DR5特异性结合后通过死亡结构域激发和传递凋亡信号，激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶级联反应，最后激活Caspase-3，活化的Caspase-3作用于其效应物并引发细胞凋亡发生［11］。结合本实验结果，我们认为TRAIL和顺铂联用可通过协同上调Caspase-3的表达，提高肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。这为TRAIL与顺铂两者之间的配伍应用于临床提供了进一步的理论基础。我们将研究TRAIL与顺铂联合用药对小鼠移植型肝癌细胞TRAIL受体以及其它凋亡相关蛋白表达的影响，为TRAIL应用于临床治疗肝癌提供进一步的实验依据。

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［2］Al masan A，Ashkenazi A.Apo2L／TRAIL：Apoptosis signaling，biology and potential for cancer t herapy.Cytokine Growth Factor Rew，2003，14（3-4）337-348

［3］Ding L，Yuan C，Wei F，et al.Cisplatin restores TRAIL apoptotic path way in glioblasto ma-derived stem cells through up-regulation of DR5 and down-regulation of c-FLIP.Cancer Invest，2011，

［4］Baritaki S，Huerta-Yepez S，Sakai T，et al.Chemotherapeutic dr ugs sensitize cancer cells to TRAIL-mediated apoptosis：up-regulation of DR5 and inhibition of Yin Yang 1.Mol Cancer Ther，2007，6（4）：1387-1399

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［6］Xu L，Yin S，Banerjee S，et al.Enhanced anticancer effect of the combination of cisplatin and TRAIL in triple-negative breast tumor cells.Mol Cancer Ther，2011，10（3）：550-557

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［10］Siervo-Sassi RR，Marrangoni，Feng X，et al.Physiological and molecular effects of Apo2L／TRAIL and cisplafin in ovarian carcinoma cell lines.Cancer Lett，2003，190（10）：61-72

［11］Kischkel FC，Lawrence DA，Chuntharapai A，et al.Apo2L／TRAIL-dependent recr uit ment of endogenous FADD and caspase-8 to death receptor 4 and 5.Immmunity，2000，12（6）：611-620

Inhibitory action and mechanism of trail combined with cisplatin on transplanted hepatocellular carcinoma in mice

Li Jing min，Ning Weiwei，Liu Tongshen，Wang Dong，Bai Xianyong＊
（Depart ment of Histology and Embr yol ogy，Binzhou Medical University，Shandong Yantai 264003，China）

Objective To st udy t he mechanis m and t he inhibitor y action of TRAIL co mbined wit h DDP on transplanted hepatocellular carcino ma in mice.Methods Mice bearing H22 hepatocellular carcinoma were rando mly divided into nor mal saline（NS）gr oup，TRAIL gr oup，TRAIL＋DDP gr oup，and DDP group.Tu mor tissues were weighted and the inhibitory rate was analysed.Hoechst 33342 stainning method was used to calculate t he apoptotic cells.The expression of Caspase-3 was measured by i mmunohistochemistry.Results Compared with NS，both TRAIL and DDP obviously inhibited the growth of transplanted hepatocell ular carcino ma in mice（P＜0.05）.They had a syner gistic effect（P＜0.05）and obviously increased the apoptotic rate of cancer cells（P＜0.05）and the expression of Caspase-3（P＜0.01）.Conclusion The co mbination of TRAIL wit h DDP has a syner gisticl y inhibitor y eff ect on t he gr owth of transplanted hepatocellular carcinoma in mice，and the mechanism may be associated with the synergistic upregulation of Caspase-3 expression.

Hepatocellular carcinoma；TRAIL；DDP；Caspase-3

R329

A

10.3870／zgzzhx.2012.02.006

2011-02-10

2011-04-01

山东省优秀中青年科学家科研奖励基金（01BS51）；山东省自然科学基金（Y2008C95）；滨州医学院科技计划（BY2008KJ27）

李京敏，女（1983年），汉族，硕士。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）