整合素α3、α6在CD151促进Hep G2细胞增殖、侵袭中的作用

费宇杰 左后娟 秦 瑾 曾和松 刘正湘

整合素α3、α6在CD151促进Hep G2细胞增殖、侵袭中的作用

费宇杰 左后娟 秦 瑾 曾和松＊刘正湘＊

（华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科，武汉430030）

目的 观察CD151转染Hep G2细胞后对细胞增殖，侵袭的影响及其与整合素的关系。方法 用脂质体转染试剂，将质粒CD151及其突变体CD151-AAA转染Hep G2细胞，观察转染后细胞增殖，侵袭的变化；免疫共沉淀法检测整合素的表达情况。结果 CD151-AAA突变体较CD151促细胞增殖力低，其侵袭力未见增强，且其免疫共沉淀未能检测到整合素的表达。结论 CD151促进Hep G2细胞增殖，侵袭有赖于CD151-整合素α3／α6复合体的形成。

细胞增殖；Transwell；CD151；CD151-AAA

肿瘤的治疗是一个世界性的难题，攻克癌症术后的复发和转移是当今医学科技攻关的重点与难点。四跨膜蛋白超家族中，CD151是其中重要的分子，其高表达于上皮细胞、内皮细胞、平滑肌和横纹肌细胞、血小板［1］。其参与了多种生物过程，包括细胞粘附、增殖、分化，信号传导，病理性血管的生成和转移等［2］。研究显示，CD151与多种肿瘤相关，其高表达多显示肿瘤病人预后不良。本实验主要研究CD151在体外对Hep G2细胞增殖，侵袭力的影响，及其与整合素α3、α6的关系，探讨CD151体外对肿瘤细胞生长的作用及其与整合素的相关性。

材料和方法

1.材料

p AAV-CD151质粒，CD151单克隆抗体5C11由美国田纳西大学健康科学中心血管生物中心和医学系张欣教授馈赠。Wester n bl ot化学发光显色系统和辣根过氧化物酶偶联兔抗鼠Ig G购自PIERCE公司。PVDF膜购自Roche公司。抗α3和α6抗体购自santa cruz公司。免疫共沉淀试剂Protein A／G-Agarose购于ab mart公司，细胞转染试剂Attractene Transf ection Reagent购 自 QIAGEN 公司。matrigel胶购自BD公司。CCK-8试剂盒购于碧云天公司。Trans well板，孔径8μm，购于Corning公司。

2.方法

2.1 CCK-8试剂盒检测p AAV-CD151及突变体p AAV-CD151-AAA转染Hep G2后对细胞增殖的影响

用高糖DMEM（GBICO）培养Hep G2细胞。将细胞接种于灭菌六孔板中，待细胞融合度达到40%-80% 用 Attractene Transfection Reagent（QIAGEN）转染试剂转染细胞，转染后的细胞置于37℃，5%细胞培养箱中孵育2-3h。用灭菌PBS洗3-4次，加入含有血清的培养基继续培养，24-48 h观察转染效率。转染48h后，将细胞消化重悬于96孔板中，每组重复3次，置于37℃细胞培养箱继续培养。细胞贴壁后，每孔加入CCK-8试剂10μl，37℃孵育1 h。酶标仪450n m波长处读数。

2.2 用Transwell板，孔径8μm，进行肿瘤细胞侵袭实验，评价各转染组对Hep G2迁移的影响

转染后的Hep G2细胞消化下来后，用含0.1%胎牛血清培养基重悬，接种于Transwell小室中，细胞密度控制在1×105和5×105／ml之间。小室预先用浓度0.3 mg／ml matrigel铺胶。小室下层加入含10%胎牛血清作为趋化因子。置37℃细胞培养箱中培养36h后，用棉签小心擦去小室上层未穿过去的细胞和matrigel胶。冰上预冷的甲醇固定，龙胆紫和伊红染色。置于相差显微镜下观察小室下层穿过的细胞，计数，每组随机取3个视野。

2.3 免疫共沉淀法检测各组整合素α3、α6的表达

用六孔板培养Hep G2细胞，转染细胞48h后，小心弃去细胞培养基，每孔加入100μl RIPA细胞裂解液，冰上裂解30 min后，用细胞刮子刮下，收集到EP管中，4℃离心机12，000×g离心20 min，上清即为蛋白液。每1 ml细胞裂解液加入20μl蛋白A／G琼脂糖混悬液，4℃摇床上孵育10 min。4℃14，000×g离心5 min以去除蛋白A／G琼脂糖，转移上清至新的离心管中。加入5C11抗体后4℃摇床上过夜。加入蛋白A／G琼脂糖30-40μl，4℃摇床上轻轻混合2h，离心取沉淀，加入40μl SDS上样缓冲液混匀。沸水中煮10 min，离心取上清各取20μl，通过10%SDS／PAGE凝胶电泳分离。4℃条件下在转膜缓冲液（Tris-HCL25 mmol／L，甘氨酸192 mmol／L，20%甲醇）中200 mA稳流维持90 min将蛋白质转至PVDF膜上。用含20%脱脂牛奶的TBST缓冲液（Tris-HCL10 mmol／L，NaCL150 mmol／L，0.05%Tween 20）封闭2.5h后，将膜放入含有相应一抗稀释液中4℃孵育过夜。TBST洗膜6次，每次10 min，将膜与标记有辣根过氧化物酶的二抗（1：8000稀释）室温下孵育2.5h，用TBST洗膜6次，每次10 min。膜与ECL试剂反应1 min后，X光片压片曝光。

3.统计学分析

采用SPSS13.0软件分析数据，两组之间比较用t检验，三组及以上用单因素方差分析检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.p AAV-CD151 及 p AAV-CD151-AAA 对Hep G2细胞增殖的影响

p AAV-CD151转染组能显著促进Hep G2细胞增殖，而 p AAV-CD151-AAA 促 细 胞 增 殖 能 力 低 于p AAV-CD151组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 用CCK-8试剂检测各组在450nm处的光密度数值Fig.1 Using CCK-8 to detect the optical density value of different groups.＊P＜0.05 vs.GFP and control groups.△P＜0.05 vs CD151 group.

2.p AAV-CD151 及 p AAV-CD151-AAA 对Hep G2细胞侵袭力的影响

p AAV-CD151转染组增强Hep G2的侵袭，而p AAV-CD151-AAA组未见细胞侵袭的增强，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

3.免疫共沉淀法检测各组整合素α3、α6的表达

p AAV-CD151转染组免疫共沉淀法检测到整合素α3、α6的表达，而p AAV-CD151-AAA 组未检测到整合素α3、α6的表达（图3）。

讨 论

癌症是严重危害人类健康的疾病之一，我国每年新增肿瘤患者260万。长期以来，肿瘤患者的临床治疗一直遵循着这样一条路线，手术—放疗—化疗，这也是目前医学界一致认同的比较成熟的治疗手段。然而在这样的治疗方式下，我国肿瘤患者5年生存率不到20%。放、化疗是一把双刃剑，在杀死肿瘤细胞的同时，也摧毁自身的免疫系统，更容易促使肿瘤细胞的转移扩散。

有没有更好的方法，既能准确杀死肿瘤细胞，同时又不损害自身的免疫系统，有效阻止肿瘤细胞的转移和扩散，这是全世界肿瘤科学家研究的方向，也是治疗肿瘤的根本出路。

目前临床肿瘤学的主要进展是分子靶向治疗。最新的一些研究发现CD151在各种肿瘤细胞中都发挥重要作用。CD151是四跨膜蛋白超家族中的重要分子，其含有四个跨膜区：一个小的细胞内环，胞内N-末端、C-末端和两个大的细胞内环［3］。文献报道，在肝细胞肝癌患者中CD151中高表达，且这种高表达与病人预后差密切相关［4］。CD151与肾脏上皮细胞癌的临床分级相关，CD151表达水平高的患者其生存率显著降低［5］。在消化道肿瘤，研究发现CD151表达水平高的患者其远处转移率增加［6］。罹患子宫内膜癌的患者，CD151可能可以作为诊断预后的新指标［7］。CD151可与c-met分子形成复合体增强人唾液腺癌细胞的致瘤性［8］。CD151高表达与乳腺癌患者，与乳腺癌进展密切相关［9］。对低分化前列腺癌患者来说，CD151指导其预后甚至优于组织学分级［10］。总而言之，CD151对于多种类别的肿瘤患者来说是一个“坏分子”。临床上对于CD151与肿瘤的预后研究甚多，但其细胞水平研究偏少。以往的资料显示CD151发挥重要的作用都需要其他四跨膜蛋白或非四跨膜蛋白分子的协同，整合素是非四跨膜蛋白中最重要的分子，其中最主要的整合素分子是α3β1 和α6β1［11］。Kazar ov等发现CD151胞外环194-196是其与整合素α3、α6结合的决定性的位点［12］。基于此，实验采用前期已构建好 的 CD151-AAA 突 变 体 （QRD194-196 →AAA194-196）转染 Hep G2细胞，观察到突变体转染的细胞其增殖力，侵袭力均较CD151组降低。说明CD151体外促肿瘤转移依赖于整合素α3／α6-CD151复合体的形成，可能为今后临床上切断肿瘤复发和转移的研究提供一个新的方向。

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Function of integrinα3 andα6 in the proliferation and invasion of Hep G2 cells promoted by CD151

Fei Yujie，Zuo Houjuan，Qin Jin，Zeng Hesong＊，Liu Zhengxiang＊
（Depart ment of car diology，Tongji Hospital，Tongji Medical college，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

Objective To obser ve t he pr olif eration and invasion of p AAV-CD151 transfected Hep G2 cells，and its correlation with the integrins.Methods Using Liposome transfection reagents，plasmid CD151 and CD151-AAA mutant were transfected into Hep G2 cell.We obser ved the pr olif eration and invasion and used co-i mmunoprecipitation assay to detecte t he expression of integrins.Results Co mpared with that of CD151，the ability of CD151-AAA mutant to promote cell proliferation decreased，and there was no enhanced invasiveness.Co-i mmunoprecipitation f ailed to detect t he expression of integrins.Concl usion CD151 i mproves proliferation and invasion of Hep G2 cells，depending on the f or mation of the CD151-integrinα3／α6 co mplex.

Pr oliferation；Transwell；CD151；CD151-AAA

R735.7

A

10.3870／zgzzhx.2012.02.001

2011-02-10

2011-04-01

国家自然科学青年基金资助（81000047，8100-0139）；高等院校博士学科点专项科研基金新教师基金（200804871035）

费宇杰，女（1983年），汉族，博士生。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）