内源性大麻素及其受体在肝硬化领域的研究进展

陆小丹 刘 萍 唐望先

（华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所，武汉430000）

肝硬化是一种或多种因素导致的慢性进展性肝病，早期出现肝细胞的广泛变性坏死，而弥漫性纤维化、假小叶和再生结节形成则是其晚期最主要的病理改变。在我国以病毒性肝硬化为主，欧美国家以酒精性肝硬化为主。临床上以肝功能损害和门静脉高压为主要表现，可出现多系统受累，如血液动力学障碍，肝硬化心肌症，肝性脑病等。目前尚无有效地治疗措施，近年来大麻素及其受体成为肝硬化发生发展机制中的研究热点，为肝硬化药物治疗靶点提供新的思路。

1.大麻素及其受体概述

大麻作为药物使用已经有几千年的历史了，大麻含有多种活性成分，其中以△9－四氢大麻酚（△9－tetrahydrocannabind，△9-THC）为主。上世纪90年代初，发现在人体内存在着一种酰胺、酯类和长链不饱和脂肪酸组成的新的脂质介质，与大麻的活性成分作用极其相似，称为内源性大麻素。主要包括两种：N-花生四烯酸氨基乙醇（anandamide，AEA）和2-花 生 四 烯 酶 甘 油 （2-arachidonoylglycerol，2-AG）。目前其它的内源性大麻素类分子也已经陆续被人 们 发 现：Noladin ether，Virodhamine，N-arachidonoyl dopamine，N-arachidonoyl-L-serine等。内源性大麻素受体主要有两种：大麻素受体－1（cannabinoid receptor 1，CB1）和 大 麻 素 受 体-2（cannabinoid receptor 2，CB2）。此外，还存在其他受体：辣椒素受体、过氧化物酶体增殖激活受体［1］。AEA与CB1的亲和力要大于CB2，而2-AG与CB1和CB2的亲和力相似［2］。CB1和CB2都是视紫红质样家族的7次跨膜受体，7个跨膜螺旋相互作用形成的中央核心是其配体结合的核心部位［3］。细胞内CB1和CB2依赖G蛋白的信号通路主要有：腺苷酸环化酶途径、MAP蛋白激酶途径、PI3激酶途径和FAK途径等。不依赖G蛋白的通路目前已经确认的有：激活鞘磷脂酶和诱导一氧化氮和环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的合成。研究发现CB受体可以调节钙离子和钾离子通道的开放。此外，由于内源性大麻素具有亲脂性，可能不依赖受体而发挥生物学效应［1］。CB1主要分布在中枢神经系统，在脂肪组织和消化道等也有表达。CB2主要分布在免疫系统，在外周组织如睾丸等有少量表达［5］。近年来研究发现CB1和CB2在正常肝脏有微弱表达或不表达，但是在酒精、肝炎病毒、胆管结扎和血吸虫感染诱发的实验性肝硬化模型中表达增加，主要表达在肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）和血管内皮细胞［4－7］，且肝脏组织中 AEA 和2-AG 的表达水平明显升高［9－11］。此外，有研究表明每天吸食大麻是丙型肝炎病人发展为肝纤维化的独立预警因素［11］。上述研究提示大麻素及其受体在肝硬化的发生发展过程中起重要的作用。

2.大麻素及其受体激动剂和拮抗剂在肝纤维化中的作用

在肝硬化病人中，内源性大麻素系统被激活，外周血AEA水平增高与肝功能受损的程度相关［12］。但也有研究表明，在发生肝硬化的病人外周血中AEA水平的升高与肝功能受损的程度无相关性［13］，肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSC）的持续激活是肝纤维化发生发展过称中的关键环节，而肝纤维化可进一步发展为肝硬化。在肝硬化患者的 HSC和四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）诱导的肝纤维化小鼠的HSC中，CB1受体表达明显上调［6］。正常人肝脏中未检测到CB2受体，而在激活的HSC的中可以检测到CB2受体［5］。

通过敲除小鼠的CB1基因或选择CB1选择性拮抗剂利莫那班（rimonabant，SR141716）作用于小鼠，小鼠的纤维化程度和肝组织的转化生长因子β水平明显降低，MFB的增殖受到抑制甚至凋亡，其机制可能是通过降低PKB／AKT或ERK的磷酸化，进而对细胞增殖的信号通路［14］造成影响。而敲除了CB2基因的小鼠与野生型小鼠相比，给予CCl4时更易发生肝纤维化［5］。当用内源性大麻素或CB2特异性的激动剂（如JWH-015）作用于体外培养的HSC时，能呈剂量依赖性的抑制HSC的增殖和促进其凋亡，而分别用COX-2的抑制剂和抗氧化剂时能减弱这种效应，推测其机制可能是通过诱导COX-2的合成，进而抑制HSC的增殖，通过启动细胞内的氧化应激促进其凋亡［15］。Javier Mu~noz-Luque等把CB2选择性激动剂（JWH-133）注入肝硬化大鼠体内后发现，肝硬化大鼠肝脏组织的α－平滑肌蛋白、和Ⅰ型胶原减少，基质金属蛋白-2增加，肝纤维化程度也明显减轻［15］。上述研究提示CB1选择性拮抗剂和CB2选择性激动剂可以做为抗肝纤维化药物的研究靶点。

在体外研究表明，AEA能选择性地使原代HSC坏死，而使用CB1和CB2的拮抗剂不能阻止这种效应，提示AEA对HSC的这种作用不是由这两类受体介导的。但在使用胆固醇耗竭剂甲基－β－环糊精后，可以有效地阻止AEA导致的HSC的坏死。由于HSC胞膜胆固醇含量丰富，推测可能与HSC胞膜的脂筏（富含胆固醇、鞘磷脂等脂质）聚集有关，进而激活胞膜的还原型辅酶Ⅱ氧化酶，使其磷酸化，进而发生级联反应产生大量的氧化族，同时还可能与HSC胞内Ca增加有关［16－17］。当肝脏发生纤维化时，循环血中的AEA浓度增加可能是机体对纤维化的一个调节反应［17－18］。由于AEA能导致HSC的坏死，进而诱发机体的局部炎症反应，还可引起系统血管舒张，进而导致有效循环血量减少，诱发腹水等。因此，AEA作为药物治疗肝硬化在临床上的应用有待进一步研究。

3.大麻素及其受体在肝硬化并发症中的作用

3.1 血液动力学

肝硬化晚期，肝小叶重建和再生结节形成使门静脉系统阻力增加和门静脉血流增多，这是门静脉高压发生的主要机制。内脏血管舒张导致高动力循环、低血压和肠系膜充血，进一步加剧了门静脉高压。越来越多的研究表明在大部分动物模型中，THC、AEA和2-AG能引起长期的低血压和心动过缓［19－22］。此外，AEA 还能 引起肠 系膜动 脉舒张，可被SR141716所阻断，而其他的CB1拮抗剂则无此作用［21］。Batkai S等发现从肝硬化大鼠和病人体内分离的单核细胞内的AEA的浓度较正常对照组明显升高，而加用SR141716后，血液动力学状态显著改善，动脉血压升高，肠系膜血流量和门静脉压降低［9］。提示其机制可能是粘附在血管内皮组织的单核细胞和血小板通过旁分泌AEA，作用于血管内皮细胞的CB1受体，激活下游的信号转导通路，增强舒血管因子的基因转录。此外，还可能与高表达CB1的血管内皮细胞对舒血管因子的敏感性增加有关。内源性大麻素引起血管舒张也可不依赖CB受体机制，Milman等发现花生四烯酸（Arachidonic acid，ARA）能产生内皮组织依赖的血管舒张，不能被SR141716和CB2选择性拮抗剂SR144528阻断，且进一步研究发现ARA与CB2不结合，与CB1的亲和力也很弱［23］。

3.2 肝硬化心肌症

大多数肝硬化患者心肌收缩力呈现标准基线，但基础心输出量在不同程度上有所增加，血管压力反应下降，导致基础心输出量增加、外周血管阻力下降、动脉压下降、心室的舒张性和（或）收缩性减弱等一系列改变，此时被称为肝硬化性心肌病（cirrhotic cardiomyopathy，CCM）［24］。Batkai S 等 发现肝硬化患者心肌组织和正常人心肌组织中CB1的表达水平相似，但是前者心肌组织中AEA的水平明显高于后者，将CB1选择性受体拮抗剂AM251静脉推注入肝硬化小鼠体内发现，肝硬化小鼠的心肌收缩力增加，低血压和心动过速的症状明显改善，推测肝硬化心肌症的发生可能与心肌中的AEA升高有关［25］。而这一研究结果与 Bonz A［26］等的研究一致。Gaskari SA等也发现心动过速－应激反应导致心肌释放的内源性大麻素增加［27］。上述研究提示AEA通过G蛋白依赖性CB1反应通路使得内源性大麻素的局部神经元产物增加，促进了CCM的发生发展。

3.3 肝性脑病

肝性脑病是肝硬化最严重的并发症和最常见的死亡原因，主要临床表现是意识障碍、行为失常和昏迷［28］。Avraham Y和Dagon等发现在硫代乙酰胺诱导的肝衰竭大鼠脑中的CB2受体及其配体2-AG升高［29－30］，注 射 非 选 择 性 CB1／CB2 激 动 剂、△9-THC［30］、2-AG、SR141716 或 CB2 选 择 性 激 动 剂HU-308［29］后，大鼠肝性脑病的症状明显改善。其中△9-THC的神经保护效应与肝功能的改善无关，且在CB2基因敲除的小鼠上未见明显的保护作用。表明这种神经保护效应来自于△9-THC与大脑中CB2的直接作用，进而激活AMP关联的蛋白激酶，在调节能量平衡的同时，通过调节神经元生成与凋亡来控制大脑的认知功能［30］。上述研究提示CB2可能成为肝性脑病具有保护作用的新靶点，然而CB1和CB2在肝性脑病发生发展中的作用和机制还需要进一步的研究［31］。

4.待 解决的问题及临床应用前景

虽然关于内源性大麻素系统在肝纤维化中的作用的证据越来越多，但是人们对于内源性大麻素系统作用的细胞靶点和的分子机制的了解还有相当长的距离。是否存在一种尚未发现的内源性大麻素介导的CB1依赖的促纤维化作用，或是否CB1的促肝纤维化不依赖配体的结合，是目前需要解决的问题，此外，还需进一步确认CB2依赖的抗炎效应在肝纤维化中的作用和体内内源性大麻素介导的纤维生成细胞凋亡能力。制造和繁殖内源性大麻素相关的某些细胞特异性成分缺失的小鼠有助于解决上述部分问题［32］。

目前内源性大麻素系统临床应用主要集中在肥胖、代谢综合征、疼痛、心血管疾病、糖尿病、帕金森病、酗酒、多发性硬化病等［33］。关于内源性大麻素系统在临床上治疗肝硬化的数据有限，而且目前的研究结果均来源于动物和体外培养的细胞，药物方面主要集中在CB1拮抗剂和CB2激动剂。CB1选择性拮抗剂利莫那班已经被批准用于肥胖和非酒精性脂肪性肝炎的治疗。但近年来，发现在因不良反应而中止利莫那班临床试验的患者中，约有一半归因于神经精神效应，如情绪压抑、焦虑、情绪激动和睡眠障碍，且呈现明显的剂量依赖性，与CB1在中枢神经系统的分布密切相关［34］。利莫那班用于抗小鼠肝纤维化的剂量是用于治疗肥胖病人剂量的20倍，如果用于治疗肝纤维化时，神经精神效应的发生几率就会相应升高［32］。因此，在利用CB1选择性拮抗剂治疗肝硬化之前，关于CB1拮抗剂安全性方面的调查结果需要慎重考虑。总之，内源性大麻素及其受体在肝纤维化的治疗方面带来了新的希望。

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