小脑星形胶质细胞功能的最新进展

杨昌建 戴泽平

（皖南医学院附属弋矶山医院麻醉科，安徽 芜湖 241001）

在双光子显微镜和荧光钙指示器的多细胞药物负荷帮助下，我们对星形胶质细胞的功能认识已发生飞跃。最近，大多数研究集中在大脑皮质的星形胶质的功能。这些研究证实：星形胶质细胞随钙离子浓度的增加，经须偏离圆柱皮质而选择视皮质。癫痫发作后，病态脑中的钙信号是增强的[1]。其他非成像研究证实：星形胶质细胞通过皮质缓慢震动的作用[2]来调节睡眠[3]，显示出昼夜节律性。皮质星形胶质细胞的研究飞速发展，但是很少人知道它们的信号和功能。这篇综述将介绍在成人小脑皮质的星形胶质的知识和一些可用的工具，方法研究它们的功能。

1 小脑皮质放射状的星形胶质细胞：伯格曼胶质细胞

小脑皮质的BG星形胶质细胞和颗粒细胞丛原浆性星形胶质细胞都被描述。BG细胞是放射状的神经胶质，在早期发育时引导颗粒细胞的迁移[4]。在成人中相当于底部分子层的星形胶质细胞的功能。BG细胞位于浦肯野细胞（PC）四周，围绕PC形成菊花团，在数量上超过PC，达到8:1。每个BG细胞多达5个垂直蔓延到分子层的主干，终杻在软膜表面[5]，终止于球状顶端。不重叠的构造区域观察到皮质星形并不出现在小脑的分子层上[6]。相反，BG细胞主干大量重叠。BG细胞在平面上是定向的，因为PC呈树枝状的。许多BG细胞重叠形成神经胶质栅栏，它们是横向，定向的（平行纤维），而且旁边突出物突出主干，这些主干来源于小复合体。这些主干在BG细胞和小脑神经元中激活并区分信号肽[7]，较小的主干环绕平行纤维，脊树突在神经元上分化成数百个微小投射，并排列成功能性领域的中间神经元与许多突触，它们之间相互环绕。在分子水平上，BG细胞主干神经元的构造表明他们机能地相互作用并显示小脑的功能。

谷氨酰天冬氨酸转运蛋白（GLAST）在BG细胞主干上浓密的表达，谷氨酸盐在细胞外间隙浓度提高，精确到微秒[8]，以致足够时间激动数百微摩尔的a-氨基羟甲基恶唑丙酸（AMPA）受体[9]。AMPA受体介导的量子事件能更深远的判断谷氨酸盐的瞬间变化，从而显示出谷氨酸盐释放途径：由突触前的神经元直接并列到AMPA受体上。

体外研究表明：平行纤维和垂直纤维同时依赖激活的AMPA受体类型，BG细胞的AMPA受体介导的趋势电流经历短期适应性。BG细胞的AMPA受体缺少G-2亚基[10]，主要依赖钙的通透性[11]，因此，在光学上测量AMPA受体需要钙信号介导。事实上，体外研究证实少部分的AMPA受体突触激发钙信号[12]，BG细胞小复合体阻断AMPA受体，同样阻断钙信号。而且，在PC的突触中，随钙通透性的降低，AMPA受体在BG细胞主干中减少，导致反常神经支配纵形纤维。通过钙通透性的超表达，AMPA受体在BG细胞主干中增多[13]。集中在BG细胞主干上的r-氨基丁酸受体抑制突触传递，这表明BG既能兴奋突触传递还能抑制突触传递，BG细胞的不同部位有不同的突触类型，因此有不同的功能。它们在BG细胞中联合起作用的。

利用转基因病毒技术，荧光钙传感蛋白的镶嵌表达来研究钙信号，它包括局限在BG亚细胞内的钙信号，通过谷氨酸释放突触驱使的。这样的信号与麻醉深度起相反的作用。它有可能增加清醒动物的神经元活动的频率。仅轻微增加异氟烷的麻醉深度，可以显著降低相邻神经元的活动。清醒小鼠可通过谷氨酸受体拮抗剂和河豚毒同样阻断BG信号[14]。

除亲离子受体，BG同样表达G蛋白耦合受体，它可使细胞内储存的钙发生变化。嘌呤能受体的小分子团和P2Y核苷酸受体是促代谢的受体，传导细胞内的钙信号，引起星形细胞钙波传播[15]。小脑中的这种机制用于表达信号。功能领域包括小部分中间神经元和PC细胞。我们在小脑中发现P2Y核苷酸受体拮抗剂PPADS和舒拉明可阻断放射状的钙波。在体内ATP触发数百万个BG主干的放射状的钙波，这种波在低浓度异氟烷麻醉下有0～80mHz/mm2。这种波在分子层面由许多部位引起的，但是自发的波来自同一部位，说明那里有波源。目前，小脑胶质细胞波的起源和终止并不知道。通过激活P2Y受体的活动，星形胶质细胞释放的ATP可以增加海马中间神经元的兴奋性[16]。这种放射状的波有可能触发ATP辐射源的释放，能够改变中间神经元的兴奋性，相反，中间神经元可能担当ATP的角色，BG细胞主干触发神经胶质钙信号的传播。在视光膜上LE细胞中使离子沉淀，有规律调节细胞外的K+，还可能调节中间神经元和PC细胞的兴奋性。ATP同样所触发完整的LE细胞中放射状的钙波[17]。虽然知道在星形胶质细胞中增加钙需要血流速度调节[18]。它仍然需要研究：放射状的波是否需要同样的作用？体内BG细胞钙信号局限地扩散有不同的作用：下游区影响兴奋性和血流速度，还可能参与神经保护。实验证实，视网膜上LE细胞的波的传播引起血管收缩[17]。

最新进展认为活动的小鼠的神经元和星形胶质细胞的大规模成像要优于麻醉的动物，通过固定小鼠的头部观察小脑中的钙的改变。研究表明：在皮质星形细胞中运动与钙离子增加是有关联的。在小脑中我们观察到整个领域钙离子浓度增加，它包括BG主干的开始端。Nimmerjahn等人证明这样的钙变化能敏感的阻断神经元的活动和血流速度。仍不清楚的是，BG激活平行纤维，纵形纤维的活动类型是否相符合。BG微小区域的平行纤维的兴奋性引起钙变化，但是不能触发钙波。在BG细胞中观察到三个特殊的钙信号：他们是高度区别的，都是通过突触相互作用的，放射状波穿过复杂的BG主干（数万个）。在活动中观察到许多BG主干（数百个）同时活动。将来研究这个小脑皮质的神经元与神经胶质相互作用的信号肽所有成分和信息。

2 有缘膜的星形胶质细胞：原浆性星形细胞

与BG相比，颗粒细胞的原浆性星形细胞有星状的表面，更类似于皮质星形细胞，但是很少人知道它们的功能。光学和电子显微镜已经显示它们的形状。构造上分为神经纤维球和颗粒细胞[19]。

腺病毒感染的重组体产生亚细胞的钙信号，该信号约持续3秒钟，当被ATP激活时自发地在细胞之间传播后，原浆性星形细胞则表达特殊的荧光性钙指示蛋白G-CaMP2。这种性质在分子水平上类似BG细胞。未来研究将阐明原浆性星形细胞在亚细胞或在细胞之间局限扩散的过程。原浆性星形细胞在分子水平上通过神经突触的局部作用来控制信息功能（例如谷氨酸盐清除率）。

3 在完整小脑的星形胶质细胞中测量钙信号

上述星形胶质细胞功能的发现是随着新颖的基因工具和成像技术而出现的。一个重要的突破，体内钙信号成像与双光子激光显微扫描术是伴随而生的，可以更深度解决脑中高度散布的样本成像和多细胞药物负荷合成的荧光粘附酯-钙指示染料的问题[20]。在脑实质中注入该染料，成千上万神经元和胶质细胞有计划的聚集在至少直径几百微米的区域。这种非特异的成像技术用于各种细胞吸收染料。它提供信号的本质特征。因素取决于细胞类型包括着色方法、注射深度、以及染料使用的类型（例如，Fluo-4/AM，Fluo-5F/AM，或者格林BAPTA-1/AM）。通常区别神经元和胶质细胞的方法是共同注入绿荧光染料，星形胶质细胞标志物SR101显示红荧光[21]。这种方法促使神经元与胶质细胞的钙信号的研究，绿色的功能信号从红色的结构信号中分离出来。尽管这项技术很有用，但是分离技术的使用仍受限。

星形胶质细胞亚群表达FCIPs[22]，它可以解决这个问题。由胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和GLAST发起的，FCIP的基因密码引入细胞内，确保蛋白质在细胞内表达。

在体神经元和星形胶质细胞，有四种方法用于FCIPs的基因：转基因技术，细胞内电穿孔，单细胞穿孔和重组病毒。目前为止只有重组病毒成功用于成像技术。病毒载体发展人类基因理论：病毒不完全闭锁复制和宿主最低中毒。这些病毒载体整合它们的基因到宿主细胞，而其他传递基因瞬间表达保留则在染色体外。在星形胶质细胞，病毒类型用于传递FCIPs基因。不稳定表达持续数周，允许胶质细胞信号的长期成像。腹腔内注射甘露醇后，细胞外隙空间变大，有利于病毒的蔓延和蛋白质的表达[23]。

许多病毒家族和血清型用于感染星形胶质细胞。腺病毒运载体用于星形细胞的基因改变[24]。在巨细胞电游上皮的启动子启动下，我们使用腺病毒完全重组体AdEasy-1来表达FCIPs-G-CaMP2。腺病毒感染神经胶质细胞的能力强于神经元[25]，巨细胞病毒电泳上皮启动子的表达水平也是神经胶质强于神经元[26]。由于双重表达，BG细胞和原浆性星形细胞限制G-CaMP2的表达。使用这种方法，我们知道星形细胞1～25d的钙信号。

病毒控制FCIPs的表达水平，在星形胶质细胞中转基因鼠表达的FCIPs的使用允许非侵袭成像和长期成像，已经超过当前使用病毒方法，但是FCIPs的表达是有限的，沉默子阻止FCIPs的表达。

4 前景与展望

在小脑中，BG信号与运动有关，并且敏感阻断神经元的活动。在活动老鼠小脑星形细胞中，钙传感探头拓展了单天的到数天，周的胶质细胞信号的研究。更多的实验细节被要求：哪种神经元刺激体内的BG细胞及影响下游的兴奋性。转基因动物何处胶质被阻断，将提供必要的工具来解决这个问题。另外的工具研究星形胶质细胞对下游神经的影响，这个工具就是CHR2，它是单价和二价阳离子通道。在星形胶质细胞中该通道选择性的表达与FCIPs一样。神经元表达CHR2的特殊亚群的活动影响胶质细胞的活动。但是原浆性星形细胞的功能很大程度上被忽视。病毒基础研究方法将有助于揭示小脑网络功能。

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