22q11微缺失机制及临床应用研究进展

孙晓燕，王云英，纪向虹

(山东省青岛市市立医院，青岛 266000)

22q11微缺失综合征(22q11 microdeletion syndrome，22q11 DS)是由于22号染色体长臂近着丝粒端微片段22q11.21～q11.23缺失引起的遗传综合征，也是人类最常见的染色体微缺失综合征。其活产新生儿发病率约为 1/8000 ～ 1/4000［1-2］。22q11DS临床表型复杂，主要包括DiGeorge综合征(DiGeorge syndrome，DGS)、腭-心-面综合征(velocardiofacial syndrome，VCFS)和圆锥动脉干-异常面容综合征(conotruncal anomaly face syndrome，CAFS)等，上述综合征均具有共同的遗传学基础。其22q11微缺失的比例分别为 88%、85%和100%。突出表现为特殊类型的先天性心脏病、低钙血症、免疫缺陷、面容异常、腭裂、腭咽功能不全、肾脏畸形、发音及喂养困难、认知、行为及精神异常［3］。尽管22q11DS表型广泛且多样，但大多数患有先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)，且他们经常合并低钙血症、免疫功能低下、后鼻孔堵塞等异常 ，手术成功率及预后远不如非综合征型CHD患者，所以产前诊断、二级干预将成为预防严重出生缺陷的主要手段［4-5］。

1 发生机制

尽管22q11DS有各种各样的临床表型，但大多是22号染色体长臂近着丝粒端微片段22q11.21～q11.23缺失所致，典型缺失区域(typical deletion region，TDR)约 1.5 ～3.0 Mb。一般认为可分为 3 种类型，其中大约90%的患者有3 Mb大小的典型缺失区域，这段区域内包含有30多个基因。8%的患者有1.5 Mb的小缺失，这段区域内含有24个基因，另外还有极少数患者有易位或一些不典型的小片段缺失和远端缺失。在典型缺失区域里，分离出4个重复序列及30多个基因，其中较为热点的基因有DCGC R-6，DCCRl/TUPLEl/HIRA、GNB1L、TBX1、DVL222、CLATHRIN/CLTCL，UFD1 L(ubiquity fusion degradation-1-like编码蛋白降解酶1)和pcqap(pc2 glutamine/Q-rich-associatedprotein，编码多蛋白复合体PC2的亚单位)等数个关键基因［6］。

2 临床表现

22q11DS的复杂性有一部分原因是其拥有繁多的各系统的缺陷，已有超过180种临床表现被报道描述，主要涉及心脏、颌面、血管、中枢神经、免疫系统及甲状旁腺发育不良引起的低钙血症等。

2.1 心脏畸形 22q11DS患者约80%患有先天性心脏畸形，最典型的为心脏圆锥干畸形(CTD)，包括法洛四联征(TOF)、主动脉弓离断(IAA，多数是B型)、永存动脉干(PTA)、肺动脉闭锁(PS)、室间隔缺损(VSD)、大动脉异位(TGA)及右室双流出道(DORV)等。各类心脏畸形在22q11DS中发生率并不相同，其中法洛四联征占20% ～30%，主动脉弓异常占 l5%，永存动脉干占10%，室间隔缺损占15%，其他畸形占5% ～10%。22q11DS所涉及的CHD表型并不特异，而是多种多样的，也就是说几乎所有CHD类型的患者都有可能存在22q11微缺失。

其中Marino等［7］认为22q11DS中的先天性心脏病类型以永存动脉干A3型最多见，动脉干从右室发出，常与IAA伴发。永存动脉干是一种罕见的CHD，而在22q11DS中则是常见类型。这点也可以进一步提示PTA患儿应当高度警惕患有22q11DS。

2.2 颌面畸形 腭裂是VCFS的主要表现之一，70%22q11DS患者中可见腭帆发育不全［8］，也是导致语言障碍、喂养困难的重要原因。常见的颅面部畸形有:双眼距离过远、睑裂过短、眼下斜、小眼;鼻梁低凹、鼻根宽、鼻翼发育不良、鼻头突出、鼻道狭窄、鼻尖突呈灯泡样、鼻音重;小嘴、唇薄、人中长、硬腭高拱、腭咽发育不良、黏膜下腭裂、悬雍垂分裂、口角肌肉下压、鱼尖样嘴;小耳叶、耳廓反转、叠耳、方形耳廓、无耳垂、耳位低、小颌及非对称性哭型面容等。喂养困难是22q11DS常见症状之一，可表现为鼻反流、呕吐、窒息、喂养延长、吸-咽-呼吸同步。面部特征在幼儿患者中比较明显，儿童测量评价较之成人更有意义。但是临床中典型特殊面容少见，又与其他综合征的特殊面容有重叠，不容易被临床医师发现及鉴别，故单纯从特殊面容人手很难筛查22q11DS病例，易造成漏诊、误诊和混淆，缺乏可行性。

2.3 免疫缺陷 超过50%的22q11DS(特别是DGS)病人常伴细胞性免疫缺陷，其中仅不足5% 的22q11DS患者能够自身获得免疫，产生免疫抗体。免疫缺陷病表现为T细胞数量减少，胸腺体积变小。外周血80%的淋巴细胞为T细胞，故淋巴细胞计数能较好反映外周血T细胞水平。严重免疫缺陷者可有淋巴细胞减少或明显减少。也有部分患者T细胞数量正常，但其功能不一定正常，可进一步行淋巴细胞转化率等T细胞功能分析，以发现轻型患儿。儿童随着年龄增大，T细胞数量增加，感染减少［9］;但也存在胸腺萎缩，T细胞缺如的现象。但是胸腺体积与T细胞数量、T细胞功能及免疫功能是否存在关联，能否反映22q11DS的免疫状态，胸腺体积能否作为诊断依据和常规检查方法还有待研究。因患者免疫功能与胸腺大小、缺失片段长短现暂无明确关联［10］，所以建议对22q11DS病人均行免疫功能检测。22q11DS除常见细胞免疫缺陷外，还可出现体液免疫缺陷。

2.4 发育、行为和精神障碍 22q11DS患者约40%～46%存在认知功能障碍和行为障碍，体现在运动、认知、语言等方面，特别在抽象逻辑、数学运算及视觉空间记忆上更明显。家族性22q11DS患者智能障碍发生率要比新发病例高。可表现为:智能低下和语言功能障碍，注意力不集中、学习认知障碍、双相性精神异常和暴躁，妄想症，自闭症，老年痴呆症及焦虑、抑郁、强迫等精神异常。20% ～30%的22q11DS患者在成年人阶段会发展成精神分裂症。这个患病率相当于正常人群25倍多。22q11DS患者行为障碍包括注意缺陷多动障碍(ADHD)、自闭症障碍、社会能力缺失、冲动行为和情感淡漠等［11］。其中自闭症障碍症候群(ASDS)患病率较高，可以看作是22q11DS中典型的行为障碍表现。轻度的认知智力缺陷在22q11DS患者中也很常见，多项研究表明22q11DS患儿的言语能力优于操作能力，其平均 IQ 值均较低，约在 50 ～100［12］。

2.5 内分泌异常 大约70%的22q11DS患者在新生儿期会因甲状旁腺发育不良可导致低钙血症，主要表现为低钙性抽搐、碱性磷酸酶升高、血清中甲状旁腺素低。新生儿期重度低钙血症以后可以自然缓解，也可再次复发;而隐性低甲状旁腺激素血症也可能转变为低钙性低甲状旁腺激素血症。此外，22q11DS患者还可表现为生长迟缓，其中部分存在生长激素缺乏。

3 22q11DS诊断

3.1 染色体核型分析 染色体核型分析是根据染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体的有无等特征，并借助染色体分带技术对某一生物的染色体进行分析、比较、排序、编号。其分析以体细胞分裂中期染色体为研究对象。染色体核型分析包括普通带型分析(350～550条带)和高分辨技术(750～850条带)。普通带型分析可将一套单倍体染色体显示350～550条带纹，可以从整体上观察染色体结构和数目异常，但不能检出亚带缺失，所以不适合22q11DS的筛查。高分辨显带染色体分析显示750～850条带纹，可以协助分子遗传学及基因定位。但有报道显示即使是采用高分辨显带染色体分析技术，也只能检测10% ～20%的22q11DS。尽管其很难检测出22q11DS，但因它能排除有无其他染色体异常(如2三体)，且技术成熟、操作简单、费用经济，因而可作为一种初筛手段。

3.2 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH) 用特定荧光如生物素取代同位素标记DNA制备探针，与靶DNA进行原位杂交，通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，使杂交信号以荧光显示，在荧光显微镜下观察探针标记或位点的技术，如有结合位点缺失 ，则荧光缺失。此方法既有分子杂交的高度特异性和敏感性，又能在染色体原位显色，因而定位准确，结果稳定，且检测结果直观，所需标本少，已成为当前22q11DS检测的金标准。目前主要采用的商业探针有TUPLE1探针和N25探针，但这些探针主要分布22q11LCRA、LCRB区域，对不经过探针位点的远端缺失和小片段缺失缺乏检测能力。

3.3 多重PCR 一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。是检测22q11DS的方便、低成本、时间短且可靠的技术。但是，该方法必须要有父母的DNA样品做对照才能出结果，而且对纯合子扩增产物为单一条带者，不能判别是否存在22q11DS。

3.4 实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitativ PCR，FQ-PCR) 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，由于荧光信号强弱对应DNA扩增的量，从而可以计算出初始模板DNA的含量，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、拥有自动化程度高等特点。但它的应用仍有一定的局限性，如不能检测出染色体平衡易位和嵌合。

3.5 比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH) 比较基因组杂交是自1992年后发展起来的一种分子细胞遗传学技术，它通过单一的一次杂交可对某组织整个基因组的染色体拷贝数量的变化进行检查。是一种全方位检测法，可以快速、系统检测整个基因组内染色体的增加与丢失。其基本原理是用不同的荧光染料通过缺口平移法分别标记肿瘤组织和正常细胞或组织的DNA制成探针，并与正常人的间期染色体进行共杂交，以在染色体上显示的肿瘤与正常对照的荧光强度的不同来反映整个肿瘤基因组DNA表达状况的变化，再借助于图像分析技术可对染色体拷贝数量的变化进行定量研究。CGH技术的优点:①实验所需DNA样本量较少，做单一的一次杂交即可检查待检测样本的整个基因组的染色体拷贝数量的变化。②此法不仅适用于外周血、培养细胞和新鲜组织样本的研究，还可用于对存档组织的研究，也可用于因DNA量过少而经PCR扩增的样本的研究。CGH技术的局限性:CGH技术所能检测到的最小的DNA扩增或丢失是在3-5Mb，故对于低水平的DNA扩增和小片段的丢失会漏检。此外在相差染色体的拷贝数量无变化时，CGH技术不能检测出平等染色体的易位(就是姐妹染色单体同源序列的互换)。用cDNA微阵列代替中期染色体后，其分辨率大大提高 ，产生了微阵列比较基因组杂交技术(array-based CGH)，不需要染色体核型，能检测到的最小的DNA扩增或丢失是在25kb［13］。

3.6 多重连接探针扩增 (multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)MLPA是2002年由荷兰的Schouten等［14］建立的一种灵敏度极高的相对定量技术。基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链;反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。在有明确筛选方向时，如对 CHD患者筛选有无22q11微缺失，HD-MLPA是性价比最高的方法，因它能检测出经典 FISH探针以外的不典型缺失或扩增，且有快速、价廉、自动化等特点，不久有取代FISH的可能。由此可见，MLPA尤其是HDMLPA技术在较大基因多位点的定量研究中有着广泛的应用前景。

4 展望

22q11DS是最普遍的遗传综合征之一，但临床表型极其多样性，尚无现成的诊断指南。但如能从其常见、早见的CHD表型入手、采用合理的方法进行22q11微缺失检测，能够早发现先天性心脏病合并症，做好围手术期护理，预防感染，减少并发症，降低病死率提即可提高该类患者的生存期及生存质量，并为长期动态随访及遗传咨询提供依据。

目前，国内外对22q11微缺失的研究主要着眼于出生以后的人群，而在产前诊断方面的报道鲜见。但从优生优育和节约社会资源的角度来看，22q11DS的产前诊断和二级干预已是当务之急。随着产前诊断技术在22q11DS的防治中应用日益广泛，这对优生优育工作将有重要的意义。

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