成年大通牦牛骨骼肌组织学结构研究

张勤文，俞红贤，李 莉，荆海霞，魏 青，牛海林，薛 乾，梁 林

（青海大学农牧学院动物医学系，青海西宁810016）

大通牦牛是利用我国特有野牦牛遗传资源培育成功的第一个国家级牦牛新品种，也是世界上第一个牦牛培育新品种。其具有稳定的遗传性，较高的产肉性能，特别是有较强的抗逆性和对高寒草场的利用能力，对于我国牦牛的改良及促进区域经济发展都具有重要意义［1］。

有学者研究表明［2-4］，大通牦牛在生长发育过程肌酸激酶显著高于平原黄牛，表明其在高原低氧环境中，通过增强无氧代谢，增强糖酵解速率、肌肉收缩供能等满足机体能量代谢的需要。魏青［5］对不同发育阶段大通牦牛和平原黄牛肺泡结构进行比较后发现，高原牦牛出生时肺泡发育较完全，具有良好的呼吸功能，大通牦牛在出生后肺泡表现出快速发育的结构特点。但现有研究中，对大通牦牛骨骼肌组织学结构报道较少，尤其对大通牦牛骨骼肌适应高原低氧环境的组织学特点未见报道。为此，选取大通牦牛作为研究对象，并以平原黄牛为对照，通过光镜和电镜研究方法，借助计算机图像分析及形态计量术等方法研究成年大通牦牛骨骼肌的组织学结构及其适应高原低氧环境的结构特征，以丰富高原动物对低氧环境的适应性的研究内容，也为牦牛形态学研究积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

随机选取青海大通种牛场（海拔3 200m）成年牦牛（以下简称大通牦牛）和山东省莱芜地区（海拔500m以下）成年黄牛（以下简称平原黄牛）各5头，临床健康，不计性别。

1.2 方法

1.2.1 骨骼肌肌纤维直径和表面积密度的测定试验动物现场屠宰后立即取材。每头牛取臂三头肌、股四头肌、腓肠肌、背最长肌、腰肌和膈肌六个部位的肌肉，所有试验动物取材部位相同。采取的组织用40mL／L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm间隔连续切片，HE染色。每例标本选5张组织切片，Olympus BX51显微镜下观察，Olympus DP 70图像采集系统取图，分别在100倍和400倍的放大倍率下，选取不重叠、不断裂的清晰视野，共选30个视野。用Image-Pro Plus 5.1图像分析系统直接测量数据，在400倍视野下测量肌纤维直径，以图片中心为中心点做一个“十”字交叉线，测量交叉线所经过的所有完整肌纤维的直径，测量时以每条肌纤维横切的中点做十字交叉线，测两条线长度的平均值作为肌纤维的直径；在100倍的放大倍率下，以数上不数下，数左不数右为原则，计数拍摄图片内的肌纤维数，然后换算为1mm2的肌纤维数，作为被测样本的肌纤维密度。

1.2.2 骨骼肌线粒体部分参数的测定 剖检时在试验牛股四头肌取组织一块，修成1mm3大小，25 mL／L戊二醛和锇酸双重固定，取材时避开血管、脂肪组织，所有供试牦牛取材部位相同。丙酮脱水，Epon812包埋，LKB-2188超薄切片机70nm超薄切片，醋酸铀-枸橼酸铅双重染色。制成透射电镜样品，JEM-1230透射电镜观察并拍照。

参照郑富盛等［6］相关计算方法，用正方形网格测试系统以点计数法测算线粒体体积密度（volume density，VV，单位体积骨骼肌中线粒体的体积密度）、面积密度（surface density，SV，单位体积骨骼肌中线粒体外膜的面积密度）、面数密度（numerical density on area，NA，单位面积中骨骼肌中线粒体的数目）等各结构参数。

1.2.3 数据处理及统计分析 所测得肌纤维直径、表面积密度及电镜图片测得的各结构参数用SPSS11.0统计软件处理，统计结果以平均值±标准差（±sD）表示，并对大通牦牛肌纤维直径、表面积密度及线粒体各结构参数与平原黄牛相应参数进行t检验，计算差异显著性。

2 结果

2.1 骨骼肌肌纤维光镜结构及计量学分析结果

由图1和图2可见，大通牦牛骨骼肌肌纤维结构致密，明显细于平原黄牛骨骼肌，相同面积内肌纤维个数明显多于平原黄牛。由表1可知，成年大通牦牛肌纤维直径平均值为37.67μm±2.76μm，不同部位间，成年大通牦牛膈肌肌纤维直径最大，股四头肌纤维直径最小；成年平原黄牛肌纤维直径平均值为45.14μm±2.54μm，不同部位间，成年平原黄牛膈肌肌纤维直径最大，腰肌肌纤维直径最小。成年大通牦牛与成年平原黄牛肌纤维直径，无论是平均值还是不同部位肌纤维直径相比，均差异极显著（P＜0.01）。

由表1可知，成年大通牦牛肌纤维密度介于388根／mm2～596根／mm2之间，不同部位间，成牛大通牦牛腰肌肌纤维表面积密度最大，膈肌肌纤维表面积密度最小；成年平原黄牛肌纤维密度介于329根／mm2～512根／mm2之间，不同部位间，成年平原黄牛腰肌肌纤维表面积密度最大，膈肌肌纤维表面积密度最小。

成年大通牦牛与成年平原黄牛肌纤维表面积密度，无论是平均值还是不同部位肌纤维密度相比，均差异极显著（P＜0.01）。

图1 大通牦牛骨骼肌（HE，400×）Fig.1 The skeletal muscle of Datong yak（HE，400×）

图2 平原黄牛骨骼肌（HE，400×）Fig.2 The skeletal muscle of plain cattle（HE，400×）

表1 大通牦牛与黄牛骨骼肌肌纤维直径及表面积密度对比Table 1 Comparison of skeletal muscle fiber diameter and surface area density between yaks and cattle

2.2 肌纤维超微结构及形态计量学分析结果

成年大通牦牛骨骼肌细胞中线粒体平均截面积和平均体积小于成牛平原黄牛，差异极显著（P＜0.01）；而成年大通牦牛骨骼肌细胞中线粒体体积密度、面积密度、面数密度均大于成年平原黄牛，差异极显著（P＜0.01）（表2和图3～图6）。

表2 大通牦牛与黄牛骨骼肌细胞线粒体结构参数值Table 2 The mitochondrial structural parameter values between yak and cattle

图3 成年大通牦牛骨骼肌细胞线粒体分布情况（10 000×）Fig.3 The distribution of mitochondria in skeletal muscle cells of adult yak（10 000×）

图4 成年大通牦牛骨骼肌细胞线粒体一般结构（30 000×）Fig.4 The general structure of mitochondria in skeletal muscle cells of adult yak（30 000×）

图5 成年平原黄牛骨骼肌细胞线粒体分布情况（10 000×）Fig.5 The distribution of mitochondria in skeletal muscle cells of adult plain cattle（10 000×）

图6 成年平原黄牛骨骼肌细胞线粒体一般结构（20 000×）Fig.6 The general structure of mitochondria in skeletal muscle cells of adult plain cattle（20 000×）

3 讨论

3.1 大通牦牛骨骼肌肉质分析

川井田博［7］研究证明，肌束内肌纤维数是判定肉质细嫩程度重要的因素，无论是屠宰活重或日龄大小，都是以肌纤维愈细者，其肉质愈鲜嫩。Cassens R G等［8］研究则表明，肌肉横截面纹理是肌束排列的组织学表现，肌束内肌纤维愈细，肌纤维密度就愈大，肉品品质优良。随着人类生活水平的提高，越来越多的人开始关注饮食健康，在本试验结果中，大通牦牛骨骼肌肌纤维直径和表面积密度与平原黄牛比较，表现为肌纤维直径细，表面积密度大的特点，差异极显著（P＜0.01），说明成年大通牦牛较平原黄牛肉质细嫩，品质较好，营养价值高。此结果与张永辉等［9］对大通牦牛肉的营养品质分析，冶成君［10］对大通牦牛肉所做的肉质综合评价结果一致。

3.2 大通牦牛骨骼肌显微结构特点

成年大通牦牛骨骼肌肌纤维直径明显比成年平原黄牛细，表面积密度则大于平原黄牛，差异极显著（P＜0.01）。这可能与牦牛的生活环境有关，大通牦牛的放牧地平均海拔在3 200m以上，环境氧分压低，骨骼肌肌纤维受缺氧环境的影响，表现为骨骼肌肌纤维直径比平原黄牛细，表面积密度比平原黄牛大的特点。此结果与孙竹珑等［11］报道的九龙牦牛肌纤维直径细于中国黄牛的结果一致。Kiessling A等［12］研究表明，缺氧环境会影响肌纤维的生长，表现为肌纤维的长度和直径增长缓慢，说明高原低氧环境对大通牦牛骨骼肌的生长发育有一定的影响。

3.3 大通牦牛骨骼肌线粒体适应低氧的结构特点

线粒体是氧化代谢产生能量的主要细胞器，通过氧化磷酸化过程来给组织提供能量，当轻、中度低氧条件下，线粒体可以通过机体的有机调节来对低氧环境产生适应，适应的结果会导致线粒体的数目增多，体密度增大［13-15］。齐新章等［16］对高原鼢鼠和高原鼠兔心脏对低氧环境适应的研究表明，高原鼢鼠和高原鼠兔心肌线粒体面数密度多、面积密度大，从而提高了心肌组织对氧的摄取和利用能力。本试验结果显示，两种动物的骨骼肌细胞线粒体参数存在差异性。成年大通牦牛骨骼肌细胞线粒体平均体积小于成年平原黄牛，差异极显著（P＜0.01）。而线粒体体积密度、面积密度、面数密度均大于成年平原黄牛，且差异极显著（P＜0.01）。因此推测可能是为了适应高原低氧环境，大通牦牛在长期进化过程中，通过减小线粒体平均体积，增加骨骼肌线粒体面数密度、面积密度、体积密度来提高其在低氧环境中对氧的利用，以提高肌肉组织对氧的利用，以适应高原低氧环境和自身运动的需要。

［1］ 陆仲麟.充分利用野牦牛遗传资源培育牦牛新品种—青海高原牦牛新品种《大通牦牛》育种配套技术［C］.甘肃兰州：全国畜禽遗传资源保护与利用学术研讨会论文集，2005：364-366.

［2］ 李 莉，俞红贤，沈明华.不同发育期黄牛有氧和无氧代谢相关指标的测定［J］.畜牧与兽医，2008，40（5）：74-76

［3］ 沈明华.不同发育期牦牛血清中Fe3＋ 含量和CK活性的测定［J］.畜牧与兽医，2008，40（5）：105.

［4］ 常建军，李 莉，俞红贤.生长期牦牛血清和组织中LDH活性的测定［J］.湖北农业科学，2009，48（7）：1694-1696.

［5］ 魏 青.不同发育阶段高原牦牛和平原黄牛肺泡显微结构的研究［D］.青海西宁：青海大学，2009：1-48

［6］ 郑富盛.细胞形态立体计量学［M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990：1-88.

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［16］ 齐新章.高原鼢鼠和高原鼠兔心脏对低氧的适应机制［D］.青海西宁：青海大学，2009：59.