梨形四膜虫细胞毒性苯酚类似物的三维定量结构毒性相关研究＊

王远强，刘跃辉，丁 元，张娅，林治华

（重庆理工大学药学与生物工程学院 400054）

苯酚类化合物作为有机工业中一类重要的物质被广泛地用作防腐剂、防锈剂、农业化学品、生物杀伤剂、染料、杀真菌剂和杀虫剂等，其广泛存在于环境中并对环境、尤其是水环境造成严重污染［1－4］。目前苯酚等4种酚类化合物被美国环境保护局列为优先控制的有机污染物，7种苯酚类化合物被确认为中国优先控制的有机污染物；因此，苯酚类化合物的毒性研究近年来成为热点。定量构效关系（quantitative structure activity relationship，QSAR）研究在现代化学和生物化学研究领域得到了非常广泛的应用，同时在环境污染物的生物活性和生物毒性评价中发挥着重要作用［5－7］。

定量结构毒性相关性（quantitative structure－toxicity relationships，QSTR）研究是指一组化合物的生物毒性与其结构特征之间的相互关系，是一种基于化合物结构预测其毒性，并能进一步分析毒性作用机制的研究方法。近年来，QSTR研究在环境污染物、毒性研究预测方面获得了广泛的应用。本文使用比较分子相似性指数分析（comparative molecular similarity indices analysis，CoMSIA）方法对系列具有梨形四膜虫细胞毒性的苯酚类似物进行了三维定量结构毒性相关研究（3DQSTR），系统分析了立体场、静电场、疏水场及协同作用对模型的影响，并建立了相应的3D－QSTR［9－11］。

1 CoMSIA的原理及研究方法

1.1 CoMSIA简介 自CramerⅢ在1988年创建比较分子力场分析（CoMFA）方法以来，CoMFA已经发展成为三维定量构效关系（3D－QSAR）研究中使用最广泛且最有效的工具之一［12］，它主要用于研究分子周围的非键分子场（立体场与静电场）改变时，其相应的活性所发生的变化［13－16］。1994年，Klebe等［16］提出CoMSIA方法，该方法是CoMFA的一种扩展，两者的原理基本相同，都基于如下假设:分子的亲和力改变时，其分子性质也发生相应变化，其分子性质以分子场的形式表现。

1.2 数据来源 本研究中50个具有梨形四膜虫细胞毒性的苯酚类化合物来自文献［9］，化合物名称及其活性见表1，该类化合物的公共结构见图1。在本研究中，从50个苯酚类似物中随机选择10个化合物组成测试集，用于测试3D－QSTR模型的预测能力；剩余的40个苯酚类似物则组成的训练集建立3D－QSTR模型。

图1 苯酚类化合物的公共结构

图2 苯酚类化合物的分子叠合图

1.3 分子叠合 本研究以毒性最强的苯酚化合物（2，4－二溴－6－苯基苯酚）作为模板，首先对该化合物进行系统搜索及分子力学优化，确定其最低能量构象，其他分子则以该分子为模板做结构修饰并进行能量优化，最后基于公共结构进行分子叠合。具体步骤为:首先选取活性最强的苯酚类化合物分子，对其进行系统构象搜索，选择最低能量构象并用MMFF94力场进行分子力学优化；然后以该分子为模板构建其他分子，并用MMFF94力场进行分子力学优化，优化的收敛条件均为能量RMS值小于0.05KJ·mol·nm－1。

由于本文研究对象均为具有苯环结构的苯酚类化合物，所以认为是较刚性的分子，经过上述分子力学优化的构象即为化合物的活性构象，在分子叠合过程中，选择活性最强的苯酚化合物（2，4－二溴－6－苯基苯酚）作为叠合模板，以公共结构（原子1－8）进行分子叠合，叠合后的分子骨架见图2。

1.4 CoMSIA分析 在用CoMSIA分析时，首先在叠合后的所有分子集合区产生边长为0.2Å的格点，并用4Å的边界确定所有叠合分子的区域。用CoMSIA提供的缺省探针计算分子在每个格点上的立体场、静电场、疏水场，在得到每个格点的分子场后，用偏最小二乘（partial least square，PLS）方法建立分子场参数与活性的3D－QSTR，并用“留一法”（leave one out，LOO），交互校验（cross validation，CV）方法检验模型的统计学差异以及确定模型的主成分数，以最优的交互校验值确定的主成分数并建立非交互校验的3D－QSAR模型，模型质量由交互检验相关系数（Q2）、相关系数（r2）、预测标准差（standard error prediction，SEP）和F统计值评价。本研究的计算工作在SGI Fuel工作站用SYBYL6.9完成。

2 结 果

在本研究中，分别对训练集化合物的立体场、静电场、疏水场及不同分子场的协同进行CoMSIA分析，各3D－QSTR模型的统计结果见表2；在用PLS方法建立QSAR模型时，用最优Q2确定的主成分数建立非交互校验相关模型。表2中的模型参数显示:使用静电场与疏水场协同作用建立的3D－QSAR模型具有较强的稳定性和良好的预测能力，该模型所用主成分数为4，Q2为0.767，r2为0.933，SEP为0.179，F检验值为157.914。使用CoMSIA方法分别对3种分子场建立3D－QSTR模型，其中相关性最好、预测能力最强的是用静电场所建立的模型（Q2＝0.749，r2＝0.891），其次是用疏水场作用建立的模型，而用立体场（Q2＝0.040，r2＝0.229）预测能力相对较差，说明静电场对化合物亲和力的影响最明显。在用任意两种分子场所建立的模型中，用静电场与疏水场建立的3D－QSTR模型具有相对最优异的预测能力（Q2＝0.767，r2＝0.933）；在该模型中，静电场对模型的贡献为67%；同时使用3种分子场所建模型中，静电场的贡献也达到59.1%。由此可见，静电场对模型的贡献是非常明显的，而使用立体场与疏水场的协同作用则相对较差。分析表2中的所有QSTR模型可以发现，单独使用立体场并不能建立一个理想的模型，但在有其他分子场存在的情况下立体场作用的贡献明显增强。

表1 苯酚类化合物对四膜虫细胞毒性的观察值与计算值

表2 苯酚化合物的CoMSIA模型参数

3 讨 论

对于训练集中，细胞毒性计算值与观测值的绝对误差小于0.335，说明所建立模型具有良好的估计能力，即静电场和疏水场与细胞毒性的相关性非常好；在测试集的10个化合物中，有1个化合物的预测值出现了异常情况，即与观测值的偏差比较大，但另外9个化合物的预测值与观测值吻合得比较好，其绝对误差最大为0.244。对于化合物2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚，其预测值与观测值的绝对误差达到了1.103，这可能是由于化合物中含有2个空间位阻较大的叔丁基所引起的，也可能是实验观测值本身存在一定误差所致或实验中的偶然误差引起。

CoMSIA的一个优点就是可以分析各种分子场对毒性的影响，并可以通过3D相关性等值面图进行观察；该等值面图有助于确定影响毒性的分子场重要区域，也可以标记对活性具有重要贡献的分子场特征。苯酚类化合物的静电场、疏水场等值面图如图3、4所示。结合静电场的等值面图中（图3）与具体的化合物进行分析可知:在6位（红色区域）有相对较大的基团时，使用负电性较强的取代基可以增加化合物的毒性，在2、3、5位（蓝色区域）附近的区域则应该使用正电性较强的取代基。疏水场相关性等值面图（图4）显示:在分子的2～5位取代位置上都不适合有立体位阻较大的基团。

图3 CoMSIA分析静电场等值面图

图4 CoMSIA分析疏水场等值面图

Cramer等［13］采用量子化学方法对该系列苯酚类化合物进行QSTR，作者分别使用AM1、PM3、PM5与DFT方法计算了苯酚的分子质量（Mw）、最高能量轨道（εHOMO）、最低能量轨道（εLOMO）、硬度（η）、柔软性（S）、化学势（μ）、亲电指（ω）数及总能量（TE），建立了良好的定量结构毒性相关模型（表3）。尽管本文使用CoMSIA方法所建立的模型与文献研究结果相比没有优势，但是CoMSIA从三维空间结构讨论苯酚类似物的静电性质、空间结构与疏水性质对其细胞毒性的影响，并可通过分子等势面图为苯酚类似物的设计与改造提供直接依据。

表3 苯酚化合物的定量构毒关系模型对比

综上所述，使用静电场与疏水场建立的3D－QSTR模型，具有良好的稳定性与预测能力。分子场等值面图可直观反映出细胞毒性有重要影响的重要部位，并可由此推测在6位上有较大的负电性基团及2～5位上有带正电荷的取代基对增强细胞毒性有利。将本研究中的3D－QSTR模型与2D－QSTR研究相结合，对苯酚类化合物进行结构修饰以改善其细胞毒性具有重要意义。

［1］Olexandr I.Structure toxicity relationships of nitroaromatic compounds［J］.Mol Divers，2006，10（3）:233－245.

［2］梁桂兆，梅虎，周原，等.计算机辅助药物设计中的多维定量构效关系模型化方法［J］.化学进展，2006，18（1）:120－127.

［3］Kunal R，Gopinath G.QSTR with extended topochemical atom （ETA）indices.VI.Acute toxicity of benzene derivatives to tadpoles（Rana japonica）［J］.J Mol Model，2006，12（5）:306－316.

［4］Donatas Z.Progress in toxin formatics:the challenge of predicting acute toxicity［J］.Current Topics Med Chem，2003，3（11）:1301－1314.

［5］钟国华，胡美英.QSAR及其在农药设计中的应用和进展［J］.农药学学报，2001，3（1）:1－11.

［6］Zaliani A，Gancia E.MS2WH IM scores for amino acids:a new 3D－descriptor for peptide QSAR and QSPR studies［J］.J Chem Inf Comput Sci，1999，39（3）:525－533.

［7］李志良.定量构效关系与研究进展［J］.化学通报，1995，（9）:5－10.

［8］Beermann K，Buschmann HJ，Schollmeyer E.Acalorimetric method for the rapid evaluation of toxic substances using Tetrahymena pyriformis［J］.Thermochimica Acta，1999，337:65－69.

［9］Telvekar VN，Patel DJ，Jadhav NC，et al.Three－dimensional QSAR and pharmacophore mapping of biphenyl benzoic acid derivatives as selective humanβ3－adrenergic receptor agonists［J］.Med Chem Res，2010，19（9）:1174－1190.

［10］Pasha FA，Srivastava HK，Singh PP.Comparative QSAR study of phenol derivatives with the help of density functional theory［J］.Bioorg Med Chem，2005，13（24）:6823－6829.

［11］刘仲杰，刘叔倩.三维定量构效关系最新研究进展［J］.河北科技大学学报，1999，20（1）:17－21.

［12］丁俊杰，丁晓琴，赵立峰，等.新型三维氨基酸结构描述子的研究及其在多肽中的应用［J］.药学学报，2005，40（4）:340－346.

［13］Cramer RD，Patterson DE，Bunce JD.Comparative molecular field analysis（CoMFA）1:Effect of shape on binding of steroids to carrier proteins［J］.J Am Chem Soc，1988，110（18）:5959－5967.

［14］Gaurav A，Yadav MR，Giridhar R，et al.3D－QSAR studies of 4－quinolone derivatives as high－affinity ligands at the benzodiazepine site of brain GABAA receptors［J］.Med Chem Res，2011，20（2）:192－199.

［15］Klebe G，Abraham U，Mietzner T.Molecular similarity indices in a comparative analysis（CoMSIA）of drug molecules to correlate and predict their biological activity［J］.J Med Chem，1994，37（24）:4130－4146.