附子正丁醇、水提取物对虚寒证模型大鼠ATP酶活性及能荷的影响＊

刘 珊，滕佳林，韩冰冰，刘一洋，杨富梅

（山东中医药大学基础医学院，济南 250355）

中医学认为虚寒证多由素体阳虚，或久居寒凉之处或气虚进一步发展，或过服寒凉之品，或房事太过，伤肾阳等，以致脏腑机能减退，机体失去阳气的温煦，寒从内生，于是形成病性属虚、属寒的证候。依据中医的治疗原则“热者寒之，寒者热之”，应选用温热药进行治疗，而附子是“回阳救逆第一品”，通过观察附子对虚寒模型大鼠三磷酸腺苷（adenosine triphoshate，ATP）酶活性及能荷代谢指标的影响，分析其作用趋势、特点及规律，揭示其与寒热药物属性的内在联系，为更好地指导临床用药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级 Wistar大鼠，40只，体质量（200±20）g，雌雄各半，由鲁抗动物实验中心提供［许可证编号:SCXK（鲁）20080002］。动物室环境为SPF级，按昼夜节律自然照明，于独立送回风净化笼饲养，室温22～26℃，相对湿度40%～70%，予60Co辐照饲料和纯净水饲喂。

1.1.2 实验药物

1.1.2.1 中药材 生石膏、龙胆草、黄柏和知母，经山东中医药大学中药学院李峰教授鉴定符合《中华人民共和国药典》2010版标准。

1.1.2.2 造模药的制备 造模复方生石膏、龙胆草、黄柏和知母按比例（2.0∶1.2∶1.0∶1.5）混合后加蒸馏水煎煮2次，分别过滤，合并2次滤液，65℃水浴浓缩至含生药量生药3.2g／mL，4℃储存备用。

1.1.2.3 治疗药 附子正丁醇提取物0.3980g、附子水提物34.3558g（山东中医药大学中药学院提供），均相当于附子生药量28.35g，分别溶于水和吐温80的混合液制成混悬液，制成每毫升含有附子正丁醇0.0019g的溶液，附子水提物0.1636g，均相当于每毫升溶液含有0.135g生药。

1.1.3 试剂 ATP 标准品（adenosine 5′－triphosphate disodium salt，Grade 1，minium 99%）为 Sigma公司产品，批号:028K7009；ADP 标 准 品 （adenonisine 5′－disphosphate sodium salt，from bacterial source）为 Sigma 公 司 产 品，批 号:107K7030；AMP 标准品（adenosine 5′－monophosphate sodium salt，minium 99%）为Sigma公司产品，批号:107K7003。乙腈（批号:20090522），娃哈哈纯净水（批号:201009252113WF），生理盐水（批号:100907E05），四汀基溴化铵（批号:2009年3月15日），磷酸二氢钠（批号:2009年5月15日），磷酸三钠（批号:2009年9月18日），磷酸（批号:20100331）。ATP酶测试验盒（批号:20100824）为南京建成生物工程研究所生产。

1.1.4 主要仪器 独立送回风净化笼（型号:I5，苏州市苏杭科技器材有限公司），电子天平（型号:JA5003，上海精科天平厂），电子天平（型号:WT11001R，江苏省常州市万得天平仪器厂），恒温水浴锅（型号:HH系列，江苏金坛中大仪器厂），紫外可见分光光度计（型号:WFZ800－D3B），全自动高速冷冻离心机（型号:GL－20A，湖南离心机厂），高效液相色谱仪（二元泵、自动进样器、柱温箱、FLD检测器，型号:Agilent1100，安捷伦公司），电子体温计（型号:欧姆龙 MC－142L型，欧姆龙大连有限公司），四通道自主活动测定仪（型号:H－ZYC－1）。

1.2 方法

1.2.1 分组 将实验动物随机分为:空白对照组（10只），模型组（10只），附子正丁醇组（10只），附子水提物组（10只）。

1.2.2 模型复制 实验动物适应性喂养3d后开始造模，除空白对照组均给灌含生药量3.2g／mL的造模药5mL，每天1次，连续14d，空白对照组每天灌服等量的生理盐水。空白对照组和附子提取物组在造模过程中各意外死亡1只，故这两组分别为9只。

1.2.3 外观观察及体质量、肛温自主活动的测定 造模过程中观察并记录各组大鼠的毛发色泽、行为状态、饮食、大便等外观方面的变化。18:00开始测量肛温，使用欧姆龙电子体温计检测大鼠肛温，将涂有凡士林的测温探头插入直肠约3cm，测温计显示数字稳定蜂鸣音提示后读取数字。自主活动使用HZYC－1型四通道自主活动测定仪记录各组大鼠5min自主活动次数，各组动物平行交替进行测试。

1.2.4 治疗 按大鼠体质量给附子正丁醇、附子水提取物组大鼠灌服附子正丁醇、水提取物（每毫升含有0.135g生药），给药剂量每千克为1.35g生药，每天1次，连续7d。

1.2.5 肝组织匀浆液的制备 取出肝脏，用生理盐水洗净，称取0.5g左右置于匀浆器中，按1∶9的比例将蒸馏水和0.9%的生理盐水混匀用来研麿肝组织，之后将组织匀浆液转入离心管，置冷冻离心机，4℃以3000r／min离心15min。

1.2.6 检测方法

1.2.6.1 Na＋－K＋－ATP酶、Ca2＋－Mg2＋－ATP酶检测方法取肝组织匀浆液上清，检测方法按ATP酶试剂盒说明操作。

1.2.6.2 ATP及能荷检测方法 取肝组织匀浆液0.5mL加入预冷的2.4mmol／L的高氯酸（ClO4）100μL，3500r／min，离心10min，取上清液加入与上清液等体积的1mol／L的磷酸氢二钾（K2HPO4），调pH 至 6.5～7.0，再次3500r／min，离心10min，取上清液用0.45μm滤过膜滤过即成色谱分析样品，以上操作在4℃下完成。

1.3 统计学处理 实验数据采用统计软件SPSS17.0进行统计分析，以表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 外观指标 模型组大鼠，造模当日或第2天开始出现软便，继而出现便溏、肛门周围有污物、泄泻、食欲减少、活动减少、畏寒蜷缩、闭目无神；造模第5天出现体质量增长逐日下降、懒动、肛温温度略降、喜聚堆、皮毛疏松无光泽。空白对照组大鼠饮食、大便正常，毛发有色泽，行为状态正常。

2.2 附子提取物对虚寒证模型大鼠体质量、肛温及自主活动的影响 由表1可见，与空白对照组相比，模型组大鼠的体质量、肛温、自主活动都有下降的趋势，且模型组的肛温较空白对照组下降明显（P＜0.01）。

表1 附子提取物对虚寒证模型大鼠体质量、肛温、自主活动的影响（）

表1 附子提取物对虚寒证模型大鼠体质量、肛温、自主活动的影响（）

△:P＜0.01，与空白对照组比较。

组别 n 体质量（g） 肛温（℃） 自主活动（次）空白对照组9256.93±21.5936.84±0.55200.22±134.18模型对照组 10239.36±21.8035.98±0.70△139.60±83.16附子正丁醇 10249.19±27.1036.24±0.70155.60±90.27附子水提物9251.87±18.3936.15±0.38162.56±63.53

2.3 附子提取物对虚寒证模型大鼠 Na＋－K＋－ATP酶、Ca2＋－Mg2＋－ATP酶含量的影响 由见表2可见，与空白对照组相比，模型组大鼠 Na＋－K＋－ATP酶活性明显降低（P＜0.01）；附子水提物组比附子正丁醇组有增强的趋势，差异不明显。与空白对照组相比，模型组Ca2＋－Mg2＋－ATP酶活性明显减弱（P＜0.01）；与模型组相比，附子正丁醇组Ca2＋－Mg2＋－ATP酶活性增强（P＜0.05）；附子正丁醇组比附子水提物组 Ca2＋－Mg2＋－ATP活性增强（P＜0.05）。

表2 附子提取物对虚寒证模型大鼠Na＋K＋－ATP酶、Ca2＋Mg2＋－ATP酶含量的测定（）

表2 附子提取物对虚寒证模型大鼠Na＋K＋－ATP酶、Ca2＋Mg2＋－ATP酶含量的测定（）

△:P＜0.01，与空白对照组比较；＊:P＜0.05，与模型组比较；▲:P＜0.05，与附子正丁醇组比较。

组别 n Na＋－K＋－ATP酶（μmolpi·mgprot－1·h－1）Ca2＋－Mg2＋－ATP酶（μmolpi·mgprot－1·h－1）空白对照组9 0.9178±0.2470 1.2072±0.3918模型对照组 10 0.4050±0.2225△ 0.4628±0.1682△附子正丁醇 10 0.5043±0.1037 0.8857±0.4413＊附子水提物 9 0.6483±0.2209 0.4900±0.4185▲

2.4 附子提取物对虚寒证模型大鼠ATP含量及能荷的影响 由表3可见，与空白对照组相比，模型组ATP含量及能荷均降低（P＜0.05）；与模型组相比，附子正丁醇组能荷比例升高（P＜0.05），其他治疗组均有上升的趋势；这两项指标中，附子水提物组比附子正丁醇组有增强的趋势。

表3 附子提取物对虚寒证模型大鼠ATP含量及能荷的测定（）

表3 附子提取物对虚寒证模型大鼠ATP含量及能荷的测定（）

▲:P＜0.05，与空白对照组相比较；＊:P＜0.05，与模型对照组相比较。

组别 n ATP（μg／g） 能荷空白对照组9 0.2173±0.08620.8642±0.0635模型对照组 10 0.0528±0.0661▲ 0.6553±0.1514▲附子正丁醇 100.0572±0.0323 0.7084±0.1017＊附子水提物9 0.0936±0.09450.8049±0.0779

3 讨 论

虚寒证是阳气不足引起的寒证，虚寒证动物模型是中医证候动物模型中研究较多的一种，以北京医科大学研制者较为典型［1］。由于是间接地以寒凉因素致虚，所以在寒证病理存在的同时，虚证本身是否存在这一问题还需要解决。本实验采用的造模方药（包括比例）是北京医科大学较为成熟的虚寒证造模方药，无直接泻下药味，而动物出现明显腹泻，说明是因寒凉过度所致，也说明本造模量损伤机体元气较甚。外观指标以逐渐出现毛脏、毛枯，精神萎靡，蜷缩，倦怠乏力，便溏腹泻，受激排便增多，舌偏淡嫩、淡白，苔少为特征，体质量增长减缓，肛温较低，食量减少，饮水量较实验前减少，以上表现基本符合虚寒证表现。从体质量、肛温、自主活动来看，模型组各指标数值均小于空白对照组，特别是模型组的体温较空白组明显下降（P＜0.01），而经过治疗后各项指标又有所恢复。现代药理研究亦证实，附子能加强心血管循环、扩张血管、增强心肌收缩力、加快心率、增加心排出量和冠状动脉血流量等［2］，也具有抗炎、提高免疫力、抗肿瘤等药理活性，其中二萜生物碱类成分被认为是其特征性的活性成分［3－6］，能上助心阳，中温脾阳，下补肾阳，用于治疗虚寒证非常适合。

从虚寒证大鼠的表现来看，精神萎靡，蜷缩，倦怠乏力，体质量增长减缓，体温较低，食量减少，饮水量较实验前减少均显示虚寒证大鼠的能量代谢降低，因ATP酶是反映机体能量代谢的可靠指标，故对虚寒证大鼠ATP酶的研究具有重要意义。ATP酶是存在于组织细胞及细胞器生物膜上的一种蛋白酶，其在物质运送、能量转换、信息传递以及维持细胞膜的完整、组织代谢等方面具有重要的意义，可作为代谢紊乱及损伤组织恢复能力的可靠指标［7］。ATP酶是逆离子梯度进行细胞膜内、外转运的离子泵，其中重要的为 Na＋－K＋－ATP酶和 Ca2＋－Mg2＋－ATP酶［10］。由于 Na＋－K＋－ATP酶主要与 ATP的分解和利用有关，维持细胞正常内外离子浓度和膜电位，故其活性是反映机体能量代谢水平和生理功能状态的重要指标［11］。而在消耗ATP的同时也释放出大量的热能，所以Na＋－K＋－ATP酶的活性越高，体内能量消耗和产热过程也越强。另有实验研究表明，甲状腺激素的产热作用也与Na＋－K＋－ATP酶的关系十分密切。Ca2＋－Mg2＋－ATP酶是细胞膜上另一种重要的酶，是一种疏水的膜结合蛋白。此酶转运Ca2＋和水解ATP都需要 Mg2＋存在，故称 Ca2＋－Mg2＋－ATP 酶，其在维持细 胞内Ca2＋和Mg2＋浓度稳定，对心肌及其他肌肉的收缩、神经细胞动作电位的传导、细胞的分泌和繁殖均有重要影响［8］。该酶的主要作用涉及ATP的分解利用和细胞内外Ca2＋浓度的维持，其活性受ATP含量、Ca2＋浓度等多种因素的影响。当ATP含量下降、胞内Ca2＋浓度增高或膜脂质过氧化时，该酶的活性降低［9］。所以，Ca2＋－Mg2＋－ATP酶是衡量线粒体功能和能量代谢水平的一个重要的指标。对于虚寒证大鼠来说，模型组大鼠 Na＋－K＋－ATP酶、Ca2＋－Mg2＋－ATP酶活性都比空白对照组弱，用药各组均比模型组活性强；同时从ATP含量来看，模型组比空白对照组明显较低，治疗后又升高，能荷的趋势也是一样。

由此可见ATP酶活性降低可能是造成虚寒模型的原因之一。附子正丁醇和附子水提物能提高虚寒证大鼠的ATP酶活性及能荷的比例，有利于虚寒证大鼠的物质代谢的恢复，提高ATP酶活性有利于虚寒症的治疗，具体情况仍有待进一步研究。

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