宫清方诱导Th1/Th2亚群漂移减轻药物流产后子宫出血动物研究

李 霞 王永红 王 丽 赵向忠 周宪宾 郭钰琪 姜国胜 姚成芳，*

1.山东省医学科学院基础医学研究所(济南，250062);2.山东省肥城市中医院妇产科

药物流产因其简便、痛苦小等优点成为目前终止非意愿妊娠的首选方式，但流产后异常子宫出血一直是临床上难以解决的问题。药物流产存在6%～10%的大出血危险，其中约1% ～3%的病例因大出血而需急救处理［1］，我们前期的临床观察也证实药物流产子宫出血量明显高于负压吸引流产术［2，3］。药物流产后异常子宫出血的发病机制尚未完全阐明，随着生殖免疫研究的不断深入，免疫机制在其中的作用受到更多关注。Th1/Th2亚群漂移在妊娠中的重要作用已充分证实［4］，但其漂移状态与药物流产后子宫出血之间的关系尚未明确，对其深入探索有望进一步揭示药物流产后异常子宫出血的发病机制，为治疗提供新的靶点。宫清方是长期应用于临床减轻药物流产子宫出血的有效方剂，已获国家药品监督管理局新药临床研究批件，并顺利完成Ⅱ期临床研究。本研究探讨Th1/Th2亚群漂移与药物流产后子宫出血量间的相关性以及宫清方靶向诱导Th1/Th2亚群漂移减轻药物流产后子宫出血的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级Balb/C小鼠(山东大学实验动物中心提供)，10周龄，体重(22±2)g，雌性小鼠未交配过且证明有生育能力。置于室温24℃，相对湿度60%～65%的超净动物饲养柜内，雌雄分笼常规饲养。

1.2 实验药物

米非司酮由浙江仙琚制药股份有限公司生产。宫清方由益母草、马齿苋、党参、生蒲黄、川牛膝、枳壳、仙鹤草、当归、川芎、甘草，按10:10:6:6:6:6:5:3:3:2比例组成，常规法水煎、醇沉，回收乙醇，灭菌后4℃冰箱保存，用于小鼠灌胃给药。

1.3 试剂与仪器

大鼠抗小鼠荧光抗体:藻红蛋白－Cy5(PC5)－CD3、异硫氰酸荧光素 (FITC)－CD4、藻红蛋白(PE)－IFN－γ，PE－白细胞介素(IL)－4均购自美国BD公司。内参照β－肌动蛋白(β－actin)、IFN－γ、IL－4引物由上海博尚生物技术有限公司合成，。IFN－γ上游引物序列:CAGCTGATCCTTTGGACCCTC，下游引物序列:CCTTTTGCCAGTTCCTCCAGA。IL－4上游引物序列:TAG TTG TCA TCC TGC TCTT，下游引物序列:GTC TTT CAG TGA TGT GGAC。β－actin为内参照，上游引物序列:GGCACCACACCTTCTACAATG，下游引物序列:ACGCACGATTTCCCTCTCAG。FACS Calibur流式细胞仪购自Becton Dickinson公司;梯度PCR扩增仪(TGradient)购自德国 Biometra公司;凝胶成像系统(Alpha Imager TM 2200)购自美国Alpha公司;电泳仪购自美国Thermo公司。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组雌雄小鼠按2∶1合笼，次日清晨发现阴道栓记为妊娠第1天。孕鼠20只随机分为米非司酮大、小剂量组各10只，从妊娠第6天开始，分别灌胃米非司酮橄榄油溶剂 1.5mg/kg·d、0.88mg/kg·d，连续用药3天，分别得到70%及55%完全流产率［5］。另取孕鼠40只随机分为米非司酮组、宫清方大、中、小剂量组各10只，从妊娠第6天开始，米非司酮组灌胃米非司酮橄榄油溶剂1.5mg/kg·d，连续用药3天;宫清方大、中、小剂量组米非司酮用药方法同米非司酮组，从妊娠第6天开始，分别灌胃宫清方提取液308.16mg/kg·d、154.08mg/kg·d、77.04mg/kg·d，连续用药 5d。

1.4.2 标本收集自药物处理第1天起，小鼠阴道内置入20g定量棉球，每日更换，置于密闭EP管内，4℃保存，改良碱性正铁血红素法检测小鼠子宫出血量［6］。妊娠第11天从小鼠眼眦取血，颈椎脱臼处死。分离子宫组织剪至1mm×1mm大小，200目铜网研磨过滤，1×PBS冲洗，Ficoll密度梯度离心法分离子宫组织单个核细胞，分别用于流式抗体标记与逆转录－聚合酶链式反应(RT－PCR)检测。

1.4.3 流式抗体标记调整子宫组织单个核细胞浓度(1×106个/mL)，加入佛波酯(30ng/mL)、离子霉素(1μg/mL)、莫能霉素(1.7ng/mL)，37℃、5%C02孵育4h。收集细胞，1×PBS洗2遍，加入大鼠血清，室温避光孵育30min。将外标抗体(PC5－CD3、FITC－CD4)按说明书分别加入到细胞悬液中，4℃避光孵育30min;1×PBS洗2次。BD固定穿膜试剂盒固定穿膜(按说明书操作)，加入内标抗体(PE－IFN－γ，PE－IL－4)，4℃避光孵育30min。穿膜缓冲液洗2次，1×PBS重悬细胞，转管，上机检测。Winmidi 2.9 分析 Th1 亚群(CD3+、CD4+、IFN －γ+)及 Th2亚群(CD3+、CD4+、IL －4+)比例。

1.4.4 RT－PCR检测引物使用Primer 5.0设计，异硫氰酸胍一步法提取子宫组织单个核细胞总RNA，按RT试剂盒说明书逆转录合成cDNA，25 μl总反应体系进行常规PCR反应，退火温度58℃ ～60℃。1.5%凝胶(EB染色)水平电泳，采用Alpha凝胶成像系统分析分析图像:以β－actin为内参照，计算目的基因与同步β－actin灰度值比值作为相对表达量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠子宫出血量与Th1/Th2亚群漂移相关性

与米非司酮小剂量组比较，米非司酮大剂量组药物流产小鼠子宫出血量减少(P＜0.05)，流式细胞术检测显示，米非司酮大剂量组药物流产小鼠母胎界面Th1亚群(CD3+、CD4+、IFN－γ+)比例升高(P ＜0.05)，Th2 亚群(CD3+、CD4+、IL －4+)比例降低(P＜0.05)。Pearson相关性分析显示，子宫出血量与 Th1亚群比例负相关(r=－0.604，P＜0.05)，与 Th2亚群比例正相关(r=0.550，P＜0.05)，与 Th1/Th2比值负相关(r=－0.623，P＜0.05)。见表1。

表1 不同药物剂量组流产小鼠子宫出血量及Th1/Th2亚群变化比较(±s)

表1 不同药物剂量组流产小鼠子宫出血量及Th1/Th2亚群变化比较(±s)

Th1/Th2米非司酮小剂量组 10 27.10 ±3.82 13.29 ±2.43 4.40 ±1.01 3.20 ±1.26组别 例数 子宫出血量(μl)Th1亚群占CD3+CD4+细胞比例(%)Th2亚群占CD3+CD4+细胞比例(%)米非司酮大剂量组 10 20.89 ±3.20 17.05 ±3.21 3.39 ±0.64 5.28 ±1.73

2.2 宫清方对子宫出血量及两细胞亚群的作用

与米非司酮单独作用比较，米非司酮联合宫清方作用后小鼠子宫出血量减少(P＜0.05)，且与宫清方药物浓度呈剂量依赖性(P＜0.05);小鼠母胎界面Th1亚群比例升高(P＜0.05)，Th2亚群比例降低(P ＜0.05)，Th1/Th2升高(P ＜0.05)，提示宫清方减轻药物流产小鼠子宫出血量作用呈剂量依赖性。见表2。

表2 不同药物剂量组流产小鼠子宫出血量及Th1/Th2亚群变化比较(±s)

表2 不同药物剂量组流产小鼠子宫出血量及Th1/Th2亚群变化比较(±s)

Th1/Th2米非司酮组 10 20.25 ±4.33 16.89 ±4.21 3.24 ±0.74 5.03 ±1.67组别 例数 子宫出血量(μl)Th1亚群占CD3+CD4+细胞比例(%)Th2亚群占CD3+CD4+细胞比例(%)宫清方小剂量组 10 16.30 ±3.44 19.42 ±4.47 2.77 ±0.66 7.01 ±2.13宫清方中剂量组 10 14.42 ±3.60 23.06 ±4.91 2.18 ±0.63 10.57 ±2.78宫清方大剂量组 10 10.71 ±3.74 28.70 ±5.28 1.34 ±0.51 17.43 ±2.49

2.3 宫清方对药物流产小鼠母胎界面IFN－γ、IL－4转录水平的影响

与米非司酮组比较，米非司酮联合宫清方作用后，Th1亚群特征性细胞因子IFN－γ mRNA表达升高(P＜0.05)，Th2亚群特征性细胞因子IL－4 mRNA表达降低(P＜0.05)(图6)，提示宫清方通过上调Th1亚群特征性细胞因子转录水平、下调Th2亚群特征性细胞因子转录水平，进而优势诱导Th1/Th2平衡向Th1亚群漂移。见表3。

3 讨论

妊娠类似于成功的半同种异体移植，免疫系统进行着复杂精细的调控，诱导与维持母胎免疫耐受状态。T细胞是免疫调节的主导因素，初始T细胞遇抗原刺激后在特异性核转录因子与分化诱导因子作用下，分化为Th1、Th2等亚群，分泌特征性细胞因子，主导不同的免疫反应。Th1类细胞因子IFN－γ抑制绒毛膜促性腺激素的分泌，诱导蜕膜、绒毛细胞凋亡和母胎免疫排斥，诱导流产;Th2类细胞因子IL－4降低巨噬细胞、NK细胞活性和淋巴毒素作用，使胚胎逃逸母体免疫排斥，有利于妊娠［7］。Th1亚群与Th2亚群通过对立调节模式限制彼此免疫应答强度，维持妊娠母胎免疫耐受与免疫排斥的平衡。正常妊娠时Th1/Th2平衡向Th2漂移，有利于母胎免疫耐受的形成与维持［8］，而Th1类细胞因子的优势表达则打破母胎免疫耐受状态而导致流产［9］。

表3 各组药物流产小鼠母胎界面IFN－γ、IL－4转录水平比较(±s)

表3 各组药物流产小鼠母胎界面IFN－γ、IL－4转录水平比较(±s)

?

药物流产子宫出血量多、出血时间长是临床常见的副反应，其防治成为研究的重点与难点。动物实验证实，米非司酮能优势诱导妊娠小鼠Th1类细胞因子表达，抑制Th2类细胞因子表达［10］。临床研究亦证实米非司酮药物流产存在Th1/Th2向Th1亚群偏移，提示Th1/Th2亚群漂移在米非司酮药物流产中扮演了重要角色［11，12］，但 Th1/Th2 亚群漂移状态与药物流产后子宫出血量之间的相关性尚未明确。本研究发现，米非司酮大剂量药物流产小鼠较小剂量组子宫出血量明显减少，Th1亚群比例升高，Th2亚群比例降低，Th1/Th2比值升高。相关性分析显示，子宫出血量与Th1亚群比例及Th1/Th2比值负相关，与Th2亚群比例正相关。以上结果进一步证实Th1/Th2亚群漂移参与了米非司酮药物流产子宫出血的发生，Th1/Th2亚群漂移状态与子宫出血量密切相关，靶向诱导Th1/Th2向Th1亚群漂移的方法可能减轻药物流产后子宫出血。

药物流产后异常子宫出血属中医学“产后恶露不绝”范畴，“瘀、虚、热”是本病的主要病机，活血祛瘀是治疗本病的关键，瘀去而血行，养血益气是治疗本病的基础。宫清方具有清热化瘀、益气养血的功效，临床研究证实，该复方能显著缩短药物流产后子宫出血时间，减少子宫出血量，但其干预靶点及关键作用机制尚未完全阐明。本研究显示，宫清方可通过上调米非司酮药物流产小鼠母胎界面Th1亚群特征性细胞因子IFN－γ mRNA转录水平，同时下调Th2亚群特征性细胞因子IL－4 mRNA转录水平，优势诱导Th1/Th2向Th1亚群漂移，进而介导母胎免疫排斥，减轻流产后子宫出血。

中医药治疗妇科血症具有疗效确切、副作用小、价格低廉等优点。米非司酮药物流产中Th1/Th2亚群漂移状态与子宫出血量密切相关，宫清方通过优势诱导Th1亚群漂移促进母胎免疫排斥，减轻药物流产后子宫出血，但导致米非司酮药物流产中T细胞亚群漂移的始动因素尚未明确，对其深入探讨有望进一步阐释药物流产后异常子宫出血的发病机理及中药减轻药物流产后子宫出血的作用机制，为新药研发及临床治疗提供科学依据。

1 Cheng L.Medical abortion in early pregnancy:experience in China［J］.Contraception，2006，74:61～65.

2 Li X，Liu R，Zhang W，et al.Up－regulation of Fas/FasL activation contribute to the apoptosis enhancement of RU486 by Gong－Qing Decoction，a traditional Chinese prescription［J］.J Ethnopharmacol，2011，134:386～392.

3 李霞，刘瑞芬，彭爱新，等.宫清颗粒对人早孕绒毛、蜕膜组织细胞凋亡及信号转导的影响［J］.中国计划生育学杂志，2009，17(2):90～93.

4 Nautiyal J，Kumar PG，Laloraya M.Mifepristone(Ru486)antagonizes monocyte chemotactic protein－3 down－regulation at early mouse pregnancy revealing immunomodulatory events in Ru486 induced abortion［J］.Am J Reprod Immunol，2004，52:8 ～ 18.

5 Yang B，Zhou HJ，He QJ，et al.Termination of early pregnancy in the mouse，rat and hamster with DL111 － IT and RU486［J］.Contraception，2000(62):211～216.

6 李霞，刘瑞芬，师伟，等.宫清颗粒防治米非司酮－米索前列醇药物流产后出血的机制探讨［J］.中国新药与临床杂志，2009，28(3):177～182.

7 Calleja－Agius J，Muttukrishna S，Pizzey AR，et al.Pro－ and antiinflammatory cytokines in threatened miscarriages［J］.Am J Obstet Gynecol，2011，205(1):83.e8 ～16.

8 Piccinni MP.T cells in normal pregnancy and recurrent pregnancy loss［J］.Reprod Biomed Online，2007，14:95 ～ 99.

9 董瑞英，许燕雪，江森.不明原因习惯性流产患者Th1/Th2型细胞因子的检测［J］.中国免疫学杂志，2004，20(3):187 ～190.

10 Mao G，Wang J，Kang Y，et al.Progesterone Increases Systemic and Local Uterine Proportions of CD4+CD25+Treg Cells during Midterm Pregnancy in Mice［J］.Endocrinology，2010，151:5477～5488.

11 徐海.米非司酮终止妊娠与Thl/Th2调节的相关性研究［J］.中国计划生育学杂志，2009，17(12):720 ～722.

12 楚健子，杜惠兰，王本华.祛瘀汤对药物流产患者绒毛蜕膜Th1/Th2型细胞因子的影响［J］.陕西中医，2008，29(12):4861～4862.