大白菜褐腐病（茎基腐病）的病原菌鉴定

周慧敏 谢学文 石延霞 郭英兰 李宝聚*

（1中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2中国科学院微生物研究所，北京 100101）

大白菜〔Brassica campestrisL. ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕，属十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）。主要分布于中国北方各地，供秋冬及春季食用，其中以华北地区栽培面积最大，其栽培面积和产量居各种蔬菜之首。但是随着连作年限增加，大白菜生产中的病害在我国各大白菜种植区普遍发生，并呈现逐年加重的趋势。

2011年1月对北京、河北、江苏等地多个大白菜种植基地进行病害调查，发现大白菜上普遍出现不同程度的茎基腐烂症状，当地俗称“茎基腐病”。病菌常自靠近地面的叶柄处侵入，严重发生时，60%～70%的大白菜茎基部有此症状，严重影响了大白菜的商品价值，给生产者造成了一定的经济影响。调查分析发现，造成该病害严重发生的主要原因是管理者对大白菜“茎基腐病”的发生规律和病原菌不了解，针对这一现状，本试验对这些地区大白菜“茎基腐病”在病原菌分离的基础上，进行形态学、分子生物学鉴定和致病性测定试验，旨在为大白菜“茎基腐病”的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病样采集及症状观察

2011年1月在北京、河北、江苏等地进行大白菜病害发生情况调查，发现当地俗称的大白菜“茎基腐病”普遍发生，采集病样标本12份，并进行病样症状描述和照片采集。

1.2 病原菌的分离及形态学鉴定

用常规根腐病菌的分离方法（方中达，1998）进行病原菌分离培养：在病样茎基部病健交界处剪取10 mm2的组织块，75%的酒精消毒30 s，无菌水漂洗3次，无菌吸水纸吸干，接种在PDA培养基上，25 ℃条件下培养2 d后，纯化培养，菌种4 ℃下甘油中冷冻保存。分离到的菌株转接到PDA培养基上，25 ℃黑暗条件下培养4 d，观察菌落形态特征，并在显微镜下进行观察，拍照记录。

1.3 分子生物学鉴定

1.3.1 DNA提取 形态学研究表明，分离得到的12个菌株培养特征和显微特征均一致。随机选取3个菌株转接到PD液体培养基中，28 ℃震荡培养7 d，无菌纱布过滤培养液，收集菌丝体，高压抽滤后冻干，基因组DNA采用郭新梅等（2005）的改良CTAB法提取。

1.3.2 rDNA-ITS序列扩增及测序 采用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′）对分离物进行 PCR扩增。扩增反应在 S1000 Thermal Cycler PCR仪（BIO-RAD）上进行。反应体系为 20 μL：4 μL10×PCR Buffer反应缓冲液，2 μL 0.2 mmo1·L-1dNTPs，2 μL 10 μmo1·L-1的 1对引物，1 μL 250 ng模板 DNA，0.5 μL 5 UTaqDNA聚合酶和10.5 μL ddH2O。反应条件：94 ℃预变性4 min；每个循环94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，最后在4 ℃停止反应。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，goldview染色，经凝胶成像系统检测拍照。将扩增的 PCR产物进行测序（测序单位：中国农业科学院作物研究所），将获得的序列在GenBank的核酸序列库中进行同源性比对。

1.4 致病性测定

根据柯赫氏法则，采用贴菌片接种法对分离得到的菌株进行致病性测定，致病性试验选择在中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室中进行。病原菌在PDA培养基上培养4 d后，用打孔器打取直径为0.5 cm的菌丝块，贴到大白菜幼苗茎基部。每个菌株接种9株大白菜幼苗，设贴不含病原菌的PDA培养基块的植株为空白对照。接种后植株保湿48 h，之后转入26～32 ℃温室中进行培养，接种3 d后进行病害发生情况调查，并自发病部位重新采集病样进行病原菌的分离和鉴定。

2 结果与分析

2.1 病害症状及病原菌分离结果

2011年1月，北京、河北、江苏等地大白菜种植区出现不同程度大白菜茎基腐烂症状，植株发病后，靠近地面的叶柄首先表现病症，发病初期在叶柄上形成浅黄褐色或浅紫灰色小斑，病斑逐渐扩大，呈黄褐色、紫灰色至暗褐色，椭圆形至不规则形，病斑表面凹陷，内部组织腐败软化（图1）。从发病植株上共分离纯化得到12个菌株。

图1 立枯丝核菌引起的大白菜“茎基腐病”田间自然发病症状

2.2 病原菌的形态学鉴定

通过平板培养与显微观察表明，分离得到的12个菌株特征一致。25 ℃条件下，在PDA培养基上培养4 d，菌落浅黄色，平均直径为 （80.0±3.0）mm，菌丝稀疏，蛛丝状，边缘规则，初期菌落无色，后期逐渐变为浅黄褐色至褐色，菌落表面产生深褐色的小菌核，菌核直径1.5～5.0 mm。菌丝粗3.0～7.0 μm，分枝处缢缩，离分枝不远处形成一隔膜（图2）。参考植物病原真菌学（陆家云，2000）和真菌鉴定手册（魏景超，2004），病原菌形态学鉴定分离到的病原菌为立枯丝核菌（Mccabe et al.，1999）。

图2 病原菌培养和显微特征

2.3 ITS序列分析

用rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4对菌株R1、R7、R9基因组DNA进行PCR扩增，均得到大小为500～600 bp的单一片段（图3）。将扩增产物进行测序。然后将获得的3个菌株序列在NCBI上进行 BLAST分析，与立枯丝核菌Rhizoctonia solani菌株的相似性为 99%～100%。结果表明，供试 3个菌株均为立枯丝核菌Rhizoctonia solani，以分离物R7序列为代表序列提交到 GenBank，获得登录号为JX137115。

2.4 致病性测定结果

3个菌株分别接种大白菜幼苗，7 d后植株表现出明显的发病症状，发病初期产生水浸状浅褐色略凹陷的小斑，进一步扩展形成椭圆形至不规则形凹陷坏死病斑，病斑浅褐色，坏死腐烂状。接种症状与田间自然发病症状一致，对照植株生长正常，无病害症状（图4）。剪取病健交界处的发病组织进行病原菌的重新分离鉴定，所有发病植株均能分离到接种病原菌，进一步证明在北京、河北、江苏地区发生的大白菜“茎基腐病”的病原菌为立枯丝核菌Rhizoctonia solani。

图3 引物ITS1/ITS4扩增菌株总DNA凝胶电泳图

图4 人工接种大白菜幼苗7 d后植株发病情况

3 结论与讨论

大白菜在我国的栽培历史悠久，北方各地广泛种植，是我国广大消费者喜食的重要蔬菜。2011年，在北京、河北、江苏等地的部分大白菜种植区，当地俗称的大白菜“茎基腐病”普遍且严重发生，引起大白菜茎基部腐烂，严重影响了大白菜的产量和品质。在生产中由于对该病害的发生规律及病原情况不了解，导致无法进行及时有效的防治。本试验通过形态学、分子生物学和致病性鉴定等手段对大白菜“茎基腐病”病原菌进行鉴定，以期为该病害的防治和抗病育种奠定理论基础。

对采集到的不同地区的病样标本经病原菌分离鉴定和致病性检测，并将传统真菌形态学鉴定方法与现代分子生物学方法相结合，确定了在我国北京、河北、江苏等地大白菜“茎基腐病”的病原菌为立枯丝核菌Rhizoctonia solani，该病害与大白菜褐腐病病原菌相同，属同病异名。由立枯丝核菌引起的大白菜病害发生流行和造成的损失都较小，国内外研究也相对较少（da Silveira et al.，2000；Zhang et al.，2009）。因此，命名存在较大差异，给病害的鉴定和有效防治造成了较大困难。李明远等（1986）将由立枯丝核菌Rhizoctonia solani引起的大白菜病害命名为大白菜立枯病，吕佩珂等（1992）将由立枯丝核菌Rhizoctonia solani引起的大白菜病害命名为大白菜褐腐病，张丽（2008）将由立枯丝核菌Rhizoctonia solani引起的甘蓝病害命名为球腐病。立枯丝核菌Rhizoctonia solani是一类寄主范围广泛的土传病原菌（Liu et al.，2011）。目前，国内外已经报道的寄主包括：水稻、棉花、高粱、茄子、马铃薯、甜菜、瓜类、甘蓝等（Camporota ＆Perrin，1998；Botha et al.，2003；Atkinson et al.，2011）。

2011年，在北京、河北、江苏的部分地区由立枯丝核菌引起的大白菜“茎基腐病”普遍严重发生，田间发病严重时，病株率高达90%以上，对生产造成了较大影响。本试验通过相关研究最终确定在北京、河北、江苏等地俗称大白菜“茎基腐病”的病原菌为立枯丝核菌Rhizoctonia solani，大白菜“茎基腐病”与大白菜立枯病、褐腐病均属同病异名。

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