RP-HPLC法测定人全血中环孢素的浓度

宋和梅（连云港市第一人民医院药学部，江苏连云港 222002）

环孢素A（Cyclosporine A，CsA）具有强大的免疫抑制作用，主要用于器官移植术后的抗排异治疗和预防，由于其治疗窗狭窄、药动学个体差异大，临床应用需要对其实施治疗药物监测，优化给药方案，减少其毒副反应的发生，提高移植的成功率。当前，监测CsA血药浓度的分析方法主要是免疫分析（IA）法和高效液相色谱（HPLC）法。IA法主要包括荧光偏振免疫（FPIA）法、酶放大免疫分析（EMIT）法和放射免疫分析（RIA）法。RIA法因放射性污染、特异性较差已少用；FPIA法由于操作简便、快捷被临床广泛使用，近期因试剂供应问题国内已停止使用；与此同时，EMIT法得到了快速推广，但EMIT法试验条件苛刻，试剂的稳定性和重复性不及FPIA法。本试验建立了快速、灵敏、准确、实用的全血CsA浓度HPLC分析方法，以满足CsA治疗药物监测的需要。

1 材料

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪，包括600E四元梯度泵、在线脱气机、柱温箱、996二极管阵列检测器、Empower色谱工作站、Empower System Suitability软件（美国Waters公司）；Milli-Q超纯水器（美国密里博公司）；AE240电子分析天平（瑞士Mettler公司）；MS2振荡器（德国IKA公司）；干热式样品浓缩器（美国Pierce公司）；TDL80-2B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；溶剂过滤器（天津市威仪科技发展有限公司）；HP-01无油真空泵（天津市鑫洲科技有限公司）。

1.2 试药

CsA（纯度：99%）、环孢素D（CsD）（内标，纯度：95%）均为福建微生物研究所提供；甲醇、乙腈为色谱纯，乙醚（使用前重蒸）、氢氧化钠、盐酸、正己烷为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Nova-pak C1（8150 mm×3.9 mm，4 μm）；流动相：乙腈-甲醇-水（30.8∶51.2∶18）；流速：1 mL·min－1；柱温：55℃；检测波长：210 nm；进样量：20 μL；内标：CsD。在该色谱条件下，CsA、CsD保留时间分别约为4.5、5.6 min，CsA理论板数＞1028，对称因子为1.032，容量因子为3.538，与CsD分离良好，分离度（Rs）为1.507，无杂峰干扰。高效液相色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.标准血样；B.空白血样；C.患者血样；1.CsA；2.CsDFig 1 HPLC chromatogramA.standard blood sample；B.blank blood sample；C.blood sample of patients；1.CsA；2.CsD

2.2 溶液的配制

2.2.1 流动相的配制：按30.8∶51.2∶18体积比例分别量取乙腈、甲醇、超纯水适量，混匀，用0.45 μm孔径的滤膜真空抽滤，得上述比例的乙腈-甲醇-水流动相，使用前超声脱气10 min备用。

2.2.2 工作溶液：快速称取氢氧化钠1.0 g置于1 000 mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为0.025 mo1·L－1的氢氧化钠溶液备用。另精密量取36.5%的浓盐酸2.5 mL置于1 000 mL容量瓶中，加超纯水至刻度，摇匀，配成浓度为0.025 mo1·L－1的盐酸溶液备用。

2.2.3 标准溶液：准确称取CsA1.94 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀；精密吸取2 mL于50 mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，配成浓度为3.1 μg·mL－1的标准溶液使用，冰箱保存备用。

2.2.4 内标溶液：准确称取CsD 10.54 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀；精密吸取5 mL于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配成浓度为21 μg·mL－1的内标溶液，冰箱保存备用。

2.2.5 标准含药全血：分别精密吸取CsA标准溶液50、100、200、400、800、1 500 μL，吹干，加空白全血3.0 mL，配成浓度为51.67、103.33、206.67、413.33、826.67、1 550.00 ng·mL－1的含药全血。

2.3 血样采集

79例移植患者，行CsA谷浓度（c0）或峰浓度（c2）常规监测。c0于清晨服药前半小时内、c2于清晨服药后（120±15）min内采静脉血4 mL于肝素抗凝试管中，供CsA血药浓度测定使用。

2.4 样品处理

取含药全血3.0 mL，加CsD内标溶液100 μL、0.025 mol·L－1氢氧化钠溶液3.0 mL，混匀，用乙醚萃取3次（4、3、3 mL），每次离心（3 500 r·min－1）4 min，合并乙醚萃取液，吹干；残渣加甲醇、0.025 mol·L－1盐酸溶液各1.0 mL，复溶；复溶液用正己烷萃取2次（3、3 mL），每次离心（3 500 r·min－1）3 min，弃上层正己烷，水层加0.025 mol·L－1氢氧化钠溶液2.0 mL，混匀；再用乙醚萃取水层2次（3、3 mL），每次离心（3 500 r·min－1）3 min，合并乙醚萃取液，吹干；用流动相100 μL复溶，20 μL进样。

2.5 标准曲线的制备

分别精密吸取标准含药全血3.0 mL，按“2.4”项下方法操作，记录色谱。以CsA浓度（c）对CsA与CsD峰面积比值（y）作线性回归，得回归方程：c＝411.71y+6.30（r＝0.999 9）。结果表明，CsA浓度在50～1 550 ng·mL－1范围内线性关系良好。

2.6 回收率及精密度试验

分别精密吸取标准含药全血3.0 mL，按“2.4”项下方法操作，分别于当日和连续6 d内测定CsA浓度，计算回收率及日内、日间RSD。另取上述含药全血3.0 mL，同法测定，计算CsA与内标CsD的峰面积比值Y1；取3.0 mL空白全血6份，按”2.4”项下方法操作，止于“用流动相100 μL复溶”前，在6支尖底试管中分别加CsA标准溶液50、100、200、400、800、1 500 μ L，吹干，用流动相100 μL复溶进样，计算CsA与内标CsD的峰面积比值Y2；计算CsA提取回收率（Y1/Y2×100%）。回收率及精密度试验结果见表1。

表1 回收率及精密度试验结果Tab 1 Results of recovery and precision tests

2.7 稳定性考察

取标准含药全血分别于室温存放0、6、24、72 h后测定CsA浓度，结果RSD＜6%（1.95%～5.98%，n＝6），表明样本室温存放72 h对CsA测定结果没有影响（P＞0.05），即样本在室温存放72 h是稳定的。

2.8 干扰试验

将移植患者常用的药物，如泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、氢化可的松、硫唑嘌呤、霉酚酸酯（骁悉）、地尔硫、硝苯地平、酮康唑、头孢唑林、阿莫西林等加入空白全血中，使成适当浓度，按“2.4”项下方法操作，结果上述药物均不干扰全血中CsA的分离与测定。

2.9 CsA全血浓度监测

对79例移植患者413次全血浓度监测，其中肾移植36例，肝移植26例，骨髓移植17例，年龄33～62岁。测得c2（858.17±410.98）ng·mL－1（n＝144），范围为269.13～2 365.80 ng·mL－1，c0测得254.77±134.98 ng·mL－1（n＝269），范围为38.13～785.60 ng·mL－1。

3 讨论

乙醚对CsA萃取效率最高[1]，但分析纯乙醚含有较多的过氧化物等杂质，直接使用对色谱图产生严重干扰，以致于使测定无法进行，且不同厂家和不同批次间存在差异，重蒸后杂峰消失，使色谱图得以净化，减少对色谱柱的污染[1，2]。因此，使用重蒸乙醚非常关键。

李海菊等[1]认为样品中水的含量是影响CsA萃取回收率的主要因素，水含量越高，萃取回收率越低，故样品处理时尽量少加含水的试液。如果对“2.4”项下含水试剂氢氧化钠溶液和盐酸溶液的浓度进行优化，减少使用体积，CsA提取回收率可能会更高。CsA不溶于正己烷，在酸性条件下用正己烷洗涤乙醚提取物，能够去除乙醚提取物中脂溶性干扰物，纯化样品[3]。冯惠平等[4]发现随盐酸浓度的增大，正己烷的脱脂去除杂质能力增强，色谱图杂峰更少。

分析CsA血药浓度的HPLC法绝大多数使用反相高效液相色谱法，常用色谱柱有C18、C8和氰基柱，氰基柱所需柱温较低（55 ℃）[1]，C8柱次之（60 ℃），C18柱较高（60～72 ℃）[2～4]，方能获得较好的柱效，但柱温太高可加速色谱柱硅胶键合相的断裂，使柱效下降，缩短色谱柱的寿命。笔者观察了温度对CsA和CsD色谱行为的影响，发现升高柱温保留时间稍有减少，但峰形和分辨率改善有显著意义，在55℃时就能获得满意的峰形和分辨率，且有利于色谱柱的保护，降低分析成本。然而，样品上柱运行时间不能＜10 min，因为在8.4、9.6、12.3 min时各有一个内源性杂质峰，测定时应避开。

本法经临床79例移植患者413次全血CsA浓度监测验证，本法具有稳定性好、线性范围宽、柱温低、灵敏准确、简便快速的特点，非常适合临床CsA治疗药物监测和药动学研究。

[1]李海菊，杨 娟，王 峰，等.RP-HPLC测定全血中环抱素A[J].中国药学杂志，2005，40（11）：857.

[2]李碧峰，冯惠平，贾晋蓉，等.反相高效液相色谱法测定全血中环抱素的浓度[J].中国药师，2007，10（7）：649.

[3]李 航，胡正波，魏志奇.反相高效液相色谱法测定环孢素A的血药浓度[J].中国药业，2009，18（15）：9.

[4]冯惠平，李碧峰，陈宜锋，等.改良RP-HPLC测定全血中环孢素A的浓度[J].中国现代应用药学，2010，27（5）：433.