芳香化酶基因敲除小鼠肝组织PPARα表达及与肝脂肪变性的关系

宋汉香 王淑秋 吕少春 户田藤巳 西原利治 鲁 燕 宋汉君

(佳木斯大学基础医学院病理生理学教研室，黑龙江 佳木斯 154007)

雌激素在调节糖和脂质代谢方面的重要性已通过对芳香化酶基因敲除小鼠(ArKO)的研究得到进一步证实，即ArKO小鼠更易发展为肝脂肪变性〔1〕。过氧化物酶增殖物激活受体(PPARs)可调节脂质代谢和能量平衡，其中PPARα调控许多基因的表达，葡萄糖6磷酸酶(G6pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)等是糖异生的关键酶，对糖和脂质代谢起着关键作用，其激活可使肝脏生成葡萄糖增多，进一步导致游离脂肪酸增多，成为胰岛素抵抗(IR)的原因之一〔2〕。尽管已知PPARα在糖和脂质代谢中的几个机制，但在雌激素缺乏的动物体内，PPARα是否可以改善肝脏的脂代谢状况目前国内外尚未见报道。因此，本文拟探讨在雌激素缺乏的小鼠体内，PPARα对肝脏脂代谢的调节作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 36只6周龄雄性小鼠，分为野生型(WT)组、ArKO 组、PPARα 基 因 敲 除 (PPARαKO)组、ArKO/PPARαKO组，每组9只。实验小鼠的管理依据日本高知大学医学部动物管理准则执行，所有小鼠维持在22℃ ～25℃的12 h昼夜(光照/黑暗)循环下，并给予随意饮水和植物雌激素含量低的啮齿目动物饲料(NIH－07PLD，日本东京东方酵母股份有限公司提供)。CYP19(芳香化酶P450基因)通过同源重组、重复回交(杂交)达到统一化的 C57BL/6J遗传背景〔3〕，再以CYP19杂合小鼠(Ar+/－)杂交生产出 ArKO鼠。PPARαKO小鼠购于Jackson实验室。通过PPARαKO小鼠与Ar+/－小鼠的重复杂交，生产出 Ar+/－/PPARαKO。然后，通过Ar+/－小鼠与PPARα基因型杂交获得 ArKO/PPARαKO小鼠。各组实验小鼠均从6周龄开始每2周测定一次小鼠体重并记录每天食物摄入量。各组小鼠无疾病和死亡。

1.2 主要试剂 DNA聚合酶(5 U/μl)及Ribonuclease inhibi－tor(RB)均购自Bio Basic公司，RNA反转录酶MMLV购自Invitrogen corporation 公司，规格 200 U/μl。

1.3 方法

1.3.1 肝组织病理学观察 在各组实验小鼠2、3、4、5月龄时，分别随机处死各1只小鼠，取小鼠肝组织，用10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色作肝组织病理学观察。

1.3.2 肝组织总RNA的提取 (1)从各组剩余的5月龄小鼠肝脏提取全部RNA。(2)在25 μl终体积反应中使用200 U MMLV 反转录酶(Invitrogen corporation，Carlsbad，Ca9，2008，USA)行全部RNA的反转录(37℃1 h，根据试剂说明书操作)。(3)在一个光循环仪器(Takara Bio inc，Shiga Japan)内使用终体积为12.5 μl的SYBR Primers Ex TaqTMⅡ，以16 ng反转录的全部RNA为起始点，应用实时定量－聚合酶链反应(QRT－PCR)技术对四组不同基因型小鼠肝组织的五种基因(Gluk，PEPCK，G6pase，GLUT2，Pyrk)进行 mRNA 定量分析。

1.3.3 引物设计与合成 Gluk(NM－00111268)前导链:5′－CCCAACTGCGAAATCACCT－3′，反转链:5′－CATTTGTGGGGTGTGGAGT－3′;PEPCK(NM－011044)前导链:5′－CACCAACGTGGCTGAGACTA－3′，反 转 链:5′－CTACGGCCACCAAAGATGAT－3′;G6pase(NM－008061) 前导链:5′－TGAAACTTTCAGCCACATCCG－3′，反转链:5′－GCAGGTAGAATCCAAGCGCGAA－3′;GLUT2(NM－031197) 前导链:5′－CCTACGGCTCTGGCACTGG－3′，反转链:5′－GACTTTCCTTTGGTTTCTG－3′;Pyrk liver(NM－000292)前导链:5′－TACCACCGCCAGTTGTTTG－3′， 反 转 链: 5′－GCGGCCAGTCTTTGTCAGC－3′;对照引物 cyclophilin A(NM－008907)前导链:5′－ATGGCACTGGCGGCAGGTCC－3′，反转链:5′－TTGCCATTCCTGGACCCAAA－3′〔4〕。所给基因的相对定量值以 Cyclophilin mRNA的值为基准。

1.3.4 PCR扩增 循环参数为:94℃预变性10 min后，94℃变性30 s，60℃ 退火 30 s，72℃ 延伸3 min，循环 35 次，72℃ 延伸2 min，终止反应。扩增产物片段长度为230 bp。

1.3.5 PCR产物电泳 制作20%聚丙烯酰胺凝胶，取一份5 μl Marker和 4 μl各组 PCR 产物加样，电压为 110 V，电泳45 min。然后用凝胶成像系统在紫外灯下观察并摄片保存。

2 结果

2.1 一般情况 实验期间WT组小鼠活动度好，饮食正常，皮毛整洁，体重不同程度增加。6周龄时四种基因型小鼠体重相似。2月龄时，PPARαKO组、ArKO/PPARαKO组分别与WT组比较，食物摄入量均明显增加(P＜0.05);ArKO/PPARαKO组与ArKO组比较，前者食物摄入量增加明显(P＜0.05)。5月龄时，ArKO组、PPARαKO组、ArKO/PPARαKO组小鼠体重相似但均明显高于 WT组〔WT组:(32.2±2.1)g vs ArKO组:(40.1±1.4)g，P ＜0.05;vs.PPARαKO 组:(37.9 ±1.6)g，P ＜0.06;vs ArKO/PPARαKO组:(40.1±0.8)g，P＜0.01〕。然而，5月龄时与WT组比较，只有PPARαKO组摄食量明显增加(P＜0.05)。实验过程中，各组小鼠未发生意外死亡。见图1。

2.2 肝组织形态学及病理学观察

2.2.1 大体形态 5月龄时，WT组小鼠肝脏形态正常，其他各组小鼠肝脏均较WT组增大，包膜紧张，边缘较钝，质地略软，色变黄，表面呈花斑状，有油腻感。ArKO/PPARαKO组较其他各组小鼠肝脂肪变性程度严重。

2.2.2 光镜观察 本实验中，50%的5月龄ArKO小鼠肝细胞发生轻度肝脂肪变性。PPARαKO组小鼠3月龄时肝细胞即全部发展成脂肪变性，WT组小鼠未见肝脂肪变性，ArKO/PPARαKO组小鼠在5月龄时肝脂肪变性明显。见图2。

图1 不同时间段各组小鼠体重变化

2.3 五种基因的表达分析 Gluk、PEPCK和G6pase在后三组小鼠肝组织中的表达水平均明显高于 WT组，且 ArKO/PPARαKO组均较ArKO组显著增高(P＜0.05)。Gluk表达水平在ArKO鼠和PPARαKO鼠无明显差异(P＞0.05);PEPCK表达水平在PPARαKO鼠较ArKO鼠显著增高(P＜0.01);G6pase表达水平在ArKO鼠较PPARαKO鼠增高(P＜0.05)。然而，在四组实验小鼠中，GLUT2和Pyrk基因表达水平无明显差异。见图3，表1。

表15 月龄四组小鼠 Gluk、PEPCK、G6pase、GLUT2、Pyrk mRNA的表达( ± s，n=6)

表15 月龄四组小鼠 Gluk、PEPCK、G6pase、GLUT2、Pyrk mRNA的表达( ± s，n=6)

与WT组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与ArKO/PPARαKO组比较:3)P＜0.01

1.0017±0.0041 1.0017±0.0041 ArKO组 1.1717±0.04832) 1.1497±0.08211)3) 1.5250±0.12242) 0.9402±0.0801 0.9087±0.2030 PPARαKO组 1.2183±0.06402) 1.3133±0.13542)3) 1.2285±0.17182) 1.0087±0.1188 1.1115±0.1706 ArKO/PPARαKO组 1.7940±0.13432) 1.6750±0.12852) 1.8167±0.09712)Gluk PEPCK G6pase GLUT2 Pyrk WT组 1.0017±0.0041 1.0017±0.0041 1.0017±0.0041组1.0650±0.1108 1.0035±0.1886

图2 肝组织切片HE染色观察5月龄时各组小鼠肝脏病理改变(HE，×400)

a:Gluk;b:PEPCK;c:G6pase;d:GLUT2;e:PyrkM:marker;1:WT组;2:Arko组;3:PPARαKO 组;4:ArKO/PPARαKO组

3 讨论

在ArKO基因工程研究领域，雌激素参与碳水化合物和脂质代谢的作用已经得到详细阐述〔5，6〕，CYP19属于细胞色素P450超家族成员，可编码一种酶，催化多种哺乳动物组织的雄激素向雌激素转化〔7〕。日本的户田滕巳通过小鼠实验证明了CYP19的分裂引起脂质和葡萄糖代谢异常，进而导致肥胖、胰岛素抵抗和在性二相性方式中肝脂肪变性的发展;补充17－β雌二醇 (E2)可使代谢活性调节恢复，进而使代谢参数恢复到野生型 (WT)小鼠的水平〔7〕。

PPARs是配体激活核转录因子，属于核受体超家族，PPAR是其中的一个亚型，其分布具有高度的组织选择性，主要在肝脏和棕色脂肪组织中高表达。PPARα调节许多基因的表达，而这些基因对糖代谢及脂质代谢起关键作用:①PPARα调节了β类药物对脂质代谢的降血脂效应;②PPARα参与了肥胖的调节;③PPARα的活化作用也改善了葡萄糖和能量平衡，抑制血管炎症和纠正年龄相关性的调节障碍〔8～10〕。

肝脏脂肪变性是代谢综合征的表现之一，脂肪代谢过程中的任何一个环节发生障碍都可引起肝细胞脂肪变性。可以通过调节过氧化物酶体β－氧化途径中的一些酶类，介导载脂蛋白apoA I表达，促进脂蛋白脂肪酶合成，催化脂蛋白中的甘油三酯分解为游离脂肪酸〔11〕。PPARα还可以调节若干线粒体脂肪酸催化酶的表达，促进β－氧化过程，降低脂肪酸和甘油三酯的合成。

本实验对糖代谢及脂质代谢密切相关的五种基因在四组不同基因型小鼠肝组织中的表达水平分别进行QRT－PCR分析，观察CYP19－ArKO小鼠体内PPARα基因缺失是否会逆转肝脏脂肪变性。本研究结果显示，芳香化酶基因失活产生的肝脏脂肪变性程度不但没有被PPARα基因的去除所改善，反而被加重。这一结果表明PPARα调节的信号途径有利于生理条件下雌激素缺乏时的糖代谢和脂质代谢。

因此，在缺乏雌激素的小鼠体内，PPARα基因的表达信号对于维持肝细胞正常的糖代谢及脂质代谢起着重要作用。但小鼠PPARα基因调控肝细胞正常的糖代谢及脂质代谢的信号转导途径有必要进一步研究。

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11 Nemoto Y，Toda K，Ono M，et al.Altered expression of fatty acid－metabolizing enzymes in aromatasedeficient mice〔J〕.J Clin Invest，2000;105:1819－25.