老年呼吸道感染肺炎克雷伯菌耐药监测及产ESBLs基因型分析

聂庆东 张秀梅 孙宇峰 刘志远 谢 姣 (清华大学医院检验科，北京 00084)

近年来，随着我国抗菌药物的广泛使用，病原菌的耐药情况日趋严重，细菌产生超广谱β－内酰胺酶(ESBLs)，是导致革兰阴性菌对内酰胺类抗生素耐药的重要机制，并给临床抗感染治疗带来众多问题。肺炎克雷伯菌是引起呼吸道感染的重要病原菌之一，也是临床常见的产ESBLs菌株〔2〕。本文对我院3年内老年呼吸道感染患者痰液中分离出的肺炎克雷伯菌的耐药谱进行分析，并对其中检出含有ESBLs质粒的基因型进行初步分型。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2009年1月至2011年12月本院诊治的呼吸道感染老年患者496例，其中病房来源457例，门诊39例;年龄61～86〔平均(71.2±10.9)〕岁。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养及鉴定 细菌培养依据《全国临床检验操作规程》，按常规方法进行。细菌鉴定在API全自动微生物鉴定系统(法国生物梅里埃公司)中进行。血琼脂、中国兰及M－H琼脂培养基为北京市陆桥公司产品。

1.2.2 药敏实验 采用K－B纸片扩散法，药敏纸片为北京天坛药物生物技术开发公司产品。

1.2.3 ESBLs检测 采用美国临床实验标准化委员会(NCCLS)推荐的双纸片和表型确证试验(头孢他啶加克拉维酸，头孢噻肟加克拉维酸)检测肺炎克雷伯菌是否产ESBLs。

1.2.4 ESBLs基因型检测 提取培养后的肺炎克雷伯菌总DNA，采用PCR方法对产ESBLs菌株进行初步基因分型。PCR扩增体系为:DNA模板，1×PCR缓冲液(含 MgCl2)，0.5 μmol/L上、下游引物，0.25 mmol/L dNTP，1 U Taq DNA 聚合酶，总体积25 μl。反应条件为:94℃预变性2 min、94℃变性30 s、55℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，25 个循环，72 ℃延伸10 min。ESBLs型特异性引物均由生工生物工程(上海)有限公司代为合成，基因组提取试剂盒购自北京TIAGEN生化科技有限公司;PCR试剂盒来自大连宝生物工程有限公司。见表1。

表1 ESBLs基因型鉴定引物

2 结果

2.1 肺炎克雷伯菌检出率 496份痰液标本中病原菌培养阳性377例，检出率为76.0%;病房来源的361例，门诊来源仅16例。其中，分离出的肺炎克雷伯菌45株，占11.9%，其他检出率较高的病原菌为铜绿假单胞菌(20.1%)、金黄色葡萄球菌(9.8%)、鲍氏不动杆菌(8.2%)及大肠埃希菌(7.9%)等。

2.2 肺炎克雷伯菌的耐药性检测 药敏实验中发现肺炎克雷伯菌对大部分抗生素还保持着较高的敏感性，尤其是对亚胺培南、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星、阿米卡星的敏感性都保持在90%以上，仅对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦及复方新诺明耐药率高，达60%以上。见表2。

表2 45株肺炎克雷伯菌的对抗菌药物的耐药率(%)

2.3 产ESBLs肺炎克雷伯菌株的基因分型 采用纸片法在45株肺炎克雷伯菌中鉴定出产 ESBLs菌14株，检出率达31.1%。通过PCR方法对这14株的ESBLs基因型进行了初步分型，结果显示仅1株为单基因型，92.9%为双基因或多基因型，检出的基因型中以质粒诱导酶(TEM)、头孢噻肟酶(CTXM－14)和 β－内酰胺耐药相关酶(SHV)为主，分别为 7例(50%)、10例(71.4%)和6例(42.9%)，而 ESBLs基因型为CTX－M－1、CTX－M－2 及 OXA 的 仅 分 别 占 28.6%、7.1% 和7.1%。见表3。

表3 产ESBLs肺炎克雷伯菌株基因型分析

3 讨论

呼吸道感染是老年患者最常见的感染，且临床抗菌药物的不合理应用导致耐药菌株增多。与国内其他地区结果相似〔3，4〕，本地区老年患者呼吸道感染以革兰阴性菌为主。通过耐药性分析发现，肺炎克雷伯菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦及复方新诺明耐药率高，达60%以上，与其他报道相接近〔4〕。目前，青霉素类抗生素耐药已成了细菌感染治疗的一个普遍现象。此外，药敏结果中显示肺炎克雷伯菌对亚胺培南、呋喃妥因及阿米卡星等抗生素高度敏感，提示碳青霉烯类及酶抑制剂复合药物对肺炎克雷伯菌有较好的抗菌作用，可作为青霉素耐药后的替代药物使用。而对头孢菌素耐药率也较低，这可能与本院第三代头孢菌素的规范化使用有关。

肺炎克雷伯菌最常见的耐药机制是产ESBLs，水解青霉素及头孢菌素类的抗生素，造成多药耐药，而ESBLs是β－内酰胺酶中重要的一类。本研究显示，近3年内的产ESBLs株占临床分离肺炎克雷伯菌的31.1%，与国内其他地区分离的产ESBLs株相比偏低〔5，6〕，这种阳性率的差异与不同地区或不同医院使用第三代头孢菌素的种类、数量及时间不同而造成ESBLs的筛选及诱导不同有关。目前，发现的ESBLs依据其结构和功能主要包括TEM、SHV、邻氯青霉素水解酶(OXA)、CTX－M 和其他一些少见类别〔7〕，根据氨基酸序列相似性又可以将CTX－M型ESBLs分为 3 个主要亚组〔8〕，分别为 CTX－M－1 型(CTX－M－1、CTX－M－3、CTX－M－10、CTX－M－15 及 CTX－M－23 等)，CTX－M－2 型(CTX－M－2、CT X－M－4、CTX－M－5、CT X－M－6、和 TOHO－1 等) 及CTX－M 9 型(CTX－M－9、CTX－M－13、CTX－M－14、CTX－M－19 及 TOHO－2等)。本研究结果表明鉴定出的14株ESBLs阳性菌株中，以CTX－M－14检出率最高，占71.4%，TEM 型和SHV型其次，分别为50%和42.9%，此结果与深圳地区的检测结果相似〔9〕。与过去研究的本社区大肠埃希菌产ESBLs的亚型不同，本次检测的肺炎克雷伯菌SHV型较多，而CTX－M－1型较少，从而反映了ESBLs在不同菌属内的偏向性。本研究还发现有92.9%的ESBLs阳性菌株中同时携带2种或以上的β－内酰胺酶基因，含有多种β－内酰胺酶基因的肺炎克雷伯菌的耐药谱一般都会拓宽，而且还能通过质粒介导导致多重耐药的传播和流行。

随着抗菌药物的广泛使用，不同地区和医院因其使用抗菌药物的不同，流行的ESBLs基因型也不尽相同，因此，了解本地区肺炎克雷伯菌的耐药情况及ESBLs基因型的资料，将有助于预测未来耐药趋势，从而指导临床更合理地用药。

1 刘行超，曾桂芬，贺 英.老年患者下呼吸道感染病原菌分布及耐药性分析〔J〕.中华医院感染学杂志，2010;20(3):430－2.

2 赖国祥，林庆安，黄梁浒，等.老年下呼吸道感染患者肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌耐药性分析〔J〕.中华老年医学杂志，2003;22(3):146－9.

3 陈玉玉，张秋桂，颜向军.老年患者呼吸道感染病原菌分布及耐药性监测〔J〕. 中华医院感染学杂志，2010;20(23):3804－5.

4 李 静，钟启平.老年患者下呼吸道感染病原菌分布及药敏分析〔J〕. 天津医科大学学报，2009;15(2):216－8.

5 郝维敏，秦淑国，王 维，等.宿州市大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs的检测及基因型分布〔J〕.临床输血与检验，2007;9(4):305－9.

6 黄 烈，韦洁宏，张银辉，等.大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌产ESBLs表型与基因型分析〔J〕.中华医院感染学杂志，2009;19(1):17－20.

7 Bradford PA.Extended－spectrum beta－lactamases in 21st century:characterization，epidemiology，and detection of this important resistance threat〔J〕.Clin Microbiol Rev，2001;14(4):933－51.

8 Bonnet R.Growing group of extended－spectrum beta－lactamases:the CTX－M enzymes〔J〕.Antimicrob Agents Chemother，2004;48(1):1－14.

9 张阮章，卢月梅，胡玉华，等.产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌呼吸道分离株的基因分型及耐药性分析〔J〕.中国微生态学杂志，2010;22(7):646－8.