脐血间充质干细胞移植对阿尔茨海默病大鼠行为学的影响

王丽娟 (赤峰学院医学院，内蒙古 赤峰 024000)

阿尔茨海默病(AD)临床症状的特征是记忆和其他认知功能显著减退，导致患者无法正常思考和判断，必须由他人照料生活。随着人类平均寿命延长和人口老龄化的出现，AD对人类健康的危害变得日益突出，是威胁老年人生命健康的高发病。但由于各种技术上的原因，AD的治疗尚未取得突破性进展。成体干细胞的多潜能性为AD的治疗提供了新的思路和方法〔1〕。本实验主要观察定向诱导前后的人脐血间充质干细胞(hUCB－MSCs)海马移植对AD模型大鼠行为学的影响，旨在寻找出最佳治疗方案，为AD的治疗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 动物与材料 健康雄性Wistar大鼠40只，鼠龄6个月，质量 (400±20)g，购自大连医科大学实验动物中心。新鲜脐血由大连医科大学附属第一医院妇产科提供。在征得产妇同意后，无菌条件下采集新生儿脐血，用肝素抗凝。IMDM培养基购自Gibco公司，β－巯基乙醇、纤维结合素购自美国Sigma公司，抗ChAT抗体购自CHEMICON公司，脑立体定位仪购自日本光电公司，MG－2型迷宫购自张家港市生物仪器厂，氢溴酸东莨菪碱注射液购自上海禾丰制药有限公司，规格1 ml∶0.3 mg，D－半乳糖购自Amresco公司，用时2.5 g溶于250 ml生理盐水中。氯化铝购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 动物模型的制备 选用Wistar大鼠依据文献〔2，3〕建立动物模型。方法如下:动物采用普通饲料适应性喂养1 w以后，大鼠每日D－半乳糖腹腔注射50mg/kg及20 mg/ml AlCl3，2 ml，每日1次，连续6 w，同时在普通饲料的基础上，按体重8%的进食量添加AlCl3·6H2O，剂量111.9 mg/kg体重，喂饲90 d，采用Y－电迷宫仪训练和测定大鼠学习记忆能力。在行为学实验前10 min，一次性腹腔注射氢溴酸东莨菪碱2 mg/kg，让大鼠在迷路箱内适应3 min，顺时针给予灯光刺激(灯光区为安全区，其余为刺激区)，待其逃避至安全区，灯光继续作用15 s，然后停灯休息1 min，再给予第2次刺激，依次重复40次，大鼠在10 s内从刺激区一次性跑向安全区即被判为正确，否则均判为错误.记录正确与错误的次数。满分为100分，每出错1次2.5分。学习48 h后进行记忆测试，方法同上。学习、记忆成绩均在50分以下者为成功模型大鼠。40只大鼠采用随机数字表法分为对照组、hUCB－MSCs移植组、常氧分化移植组和低氧分化移植组，每组10只。

1.3 人hUCB－MSCs的培养及向神经元样细胞定向诱导分化依据文献〔4〕培养人 hUCB－MSCs，待细胞汇合约达70%时，用0.25%胰蛋白酶消化，按2.0×106/皿密度接种于涂有纤维结合素的35 mm培养皿中，随机分3组，即hUCB－MSCs组、常氧分化组和低氧分化组，每组6皿。脐血MSCs组、常氧分化组细胞置于CO2培养箱常氧培养;低氧分化组细胞在体积分数为3%O2的环境中培养。分化组于接种24 h后弃去培养液，用解剖液洗2次，加入预诱导液(IMDM+20%胎牛血清+1%L谷氨酰胺+1%双抗+终浓度1 mmol/L BME);预诱导24 h后弃去预诱导液，用解剖液洗2次，再加入诱导液(IMDM+1%L谷氨酰胺+1%N2+1%双抗+终浓度5 mmol/LBME)诱导5 h。诱导结束后，将3组细胞同时固定，然后进行细胞免疫化学法鉴定。按2×106个/瓶密度接种于涂有纤维结合素的75 cm2培养瓶中，分组及分化方法同上，每组5瓶，用于细胞移植。

1.4 细胞移植 常规胰酶消化各组hUCB－MSCs，并用含胎牛血清的培养液终止，制成单细胞悬液，采用血球计数板计数法在显微镜下(×100)进行计数，调整活细胞浓度为5×1011L－1备用。AD模型大鼠经3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于脑立体定位仪上，头部备皮，体积分数为75%乙醇消毒手术区皮肤，无菌操作，切开皮肤，钝性分离，参照《大鼠脑立体定位图谱》，选取双侧海马为移植区，进行移植。一侧移植用细胞量为 4 μl(2 ×105个细胞)，注射速度为 1 μl/min，留针5 min。在对照组大鼠海马脑区注入等量的生理盐水。局部消毒，缝合皮肤。

1.5 主要观察指标 分别在细胞移植前1 d和手术后8 w测定各组动物行为学，以学习、记忆成绩为客观观测指标。

1.6 统计学分析 采用SPSS19.0软件包进行统计处理，实验数据以±s表示，多样本均数比较采用方差分析。

2 结果

2.1 人hUCB－MSCs定向诱导分化为ChAT阳性神经元镜下观察 hUCB－MSCs组细胞形态无明显改变(图1);分化组hUCBMSCs经诱导可向神经元样细胞方向分化(图2)，低氧分化组hUCB－MSCs转变为神经元样形态的明显多于常氧分化组。细胞鉴定:结果显示，hUCB－MSCs组未见ChAT阳性神经元;分化组可见ChAT阳性神经元。通过计数得出:常氧分化组ChAT阳性神经元约占细胞总数的(6.8±0.3)%;低氧分化组ChAT阳性神经元约占细胞总数的(21.2±4.6)%，两组相比，差异具有非常显著性意义(P＜0.01)。

2.2 细胞移植后各组大鼠的行为学改变 由表1可知，对照组AD大鼠术后学习记忆成绩均下降，与术前相比，差异无显著性意义(P＞0.05);hUCB－MSCs移植组大鼠学习记忆成绩均提高，与移植前相比，差异无显著性意义(P＞0.05);常氧分化移植组和低氧分化移植组大鼠学习记忆成绩均提高，后者大鼠学习记忆成绩均高于前者，两者与移植前相比，差异均有显著性意义(P＜0.01);与对照组相比，其他3组大鼠学习记忆成绩均提高(P＜0.01)。

图1 人hUCB-MSCs(×400)

图2 神经元样细胞(×400)

表1 各组大鼠hUCB-MSCs移植前后学习记忆成绩变化(±s，n=10)

表1 各组大鼠hUCB-MSCs移植前后学习记忆成绩变化(±s，n=10)

与对照组比较:1)P＜0.01;与移植前比较:2)P＜0.01

组别 移植前学习分数 记忆分数移植8 w后学习分数 记忆分数对照组 40.00±2.04 40.25±2.19 39.00±1.75 39.75±2.19 MSC移植组 40.25±2.99 44.00±2.42 42.50±1.671)45.75±2.371)常氧分化移植组 39.75±2.99 40.25±2.99 45.75±2.901)2)46.00±3.161)2)低氧分化移植组 38.25±2.37 39.75±2.99 52.50±2.041)2)53.00±3.071)2)

3 讨论

AD的病因尚不清楚、发病机制非常复杂〔5～10〕，铝是一种神经毒素，易沉积于脑内而对中枢神经系统具有毒性作用，到目前为止，铝对学习记忆的抑制作用已在多数动物和人身上得到证实〔11〕。国外有学者报道铝作业工人的短期记忆能力、学习能力、视空间感知能力、心理运动能力均受到一定程度的损害。也有调查显示铝厂附近的儿童其智力要明显低于同年龄的其他儿童。动物实验发现，给猫、家兔、大鼠和小鼠等染铝，均可引起一系列行为异常，而且动物出现认知和记忆障碍的时间也早于其他指标〔6〕。D－半乳糖可致大鼠亚急性衰老，氢溴酸东莨菪碱是中枢胆碱能抑制剂，引起胆碱能系统功能障碍。因此复合型AD大鼠模型 (集衰老、胆碱能损害、铝中毒为一体的AD模型)可以更好的模拟出AD患者的病理生理及行为学表现〔12〕。本实验制作大鼠模型适合于治疗方法的筛选和疗效评价，可为临床应用hUCB－MSCs治疗AD提供实验数据，具有较强的实用性和应用性。

用于神经移植理想的细胞来源应具备:①移植的细胞在体外可大量繁殖和扩增。②安全可靠。③移植细胞能够分化为神经元和神经胶质细胞。④不需要长时期使用免疫抑制剂。间充质干细胞具备这些特性，决定了它可以作为移植治疗AD的理想细胞来源。

除此之外，间充质干细胞还具备以下优势:①取材方便，细胞来源比较充足。除脐血外，骨髓、脐带等组织也存在间充质干细胞。②在一定培养条件下，可在短时间内大量扩增。③易被稳定转染以及作为基因载体能长期表达外源性基因。④能透过血脑屏障，通过静脉内移植。⑤避免了伦理道德上的争议。⑥具有免疫耐受性或免疫无反应性。胚胎干细胞和神经干细胞已用于治疗神经系统疾病〔13，14〕，但无法在临床上推广应用，由于存在难以克服的困难，主要限制因素是存在伦理道德问题和取材非常困难，所以，寻找新的细胞来源成为细胞治疗首要解决的问题。最近，已有应用骨髓间充质干细胞治疗AD的报到〔15，16〕，但骨髓间充质干细胞实验仅限于自体移植方面，在异体移植免疫反应问题上有待进一步探索。而 hUCB－MSCs免疫源性相对较低，可以从冷冻保存长达0.5～5年的脐血中培养成功，这意味着脐血MSC有着其他来源的MSC所不具备的优势，将成为神经系统疾病移植治疗理想的种子细胞，有着广泛的临床应用前景。

hUCB－MSCs作为有潜力的治疗手段来预防各种不同的神经组织退化病包括AD正在研究〔17〕，Lee等〔18〕在体外进行了在二乙基溴乙酰胺消失过程中培养β淀粉样蛋白治疗的海马趾神经元聚集体来研究hUCB－MSCs治疗潜能。证实了hUCBMSCs共培养通过β淀粉样蛋白治疗减少了海马趾的凋亡效应。而且，在一个严重的AD鼠模型中在AD相关的认知能力和神经病理学结果方面来直接实验hUCB－MSCs的治疗效能，证明了神经胶质活化的标志、氧化应激和凋亡水平在AD鼠脑中都减少了。有趣的是，hUCB－MSCs治疗了AD鼠，证明挽救了包括学习功能的恢复的认知能力。本实验的结果提示hUCB－MSCs移植对痴呆大鼠的认知功能障碍有一定的治疗作用，且定向诱导分化的hUCB－MSCs移植治疗优于未分化的hUCB－MSCs，低氧诱导分化的 hUCB－MSCs移植治疗效果最佳。hUCB－MSCs的治疗作用究竟是通过何种机制得以实现，将在以后的研究中进一步明确。

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